固定化金属螯合亲和层析技术研究进展.doc

该论文是从以下网址获取：/col/1999/c99130.htmProgress of Immobilized Metal-chelate Affinity ChromatographyWei Qi Bao Shixiang# Yao Ruhua(South China University of Technology, Guangzhou 510641Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101)Abstract The matrix, ligands, activation, coupling and elution techniques of immobilized metal- chelated affinity chromatography(IMAC) were discussed and the characteristic of IMAC with other affinity chromatographies were compared, then the recent development and application of IMAC were reviewed, at last the mathematical models were presented.Key words Immobilized metal-chelated affinity chromatography, affinity chromatography, metal chelate摘要 本文介绍了固定化金属螯合亲和层析(IMAC)技术的发展简史，IMAC的基本原理、基质、配基、活化与偶联、洗脱方法，对IMAC的优劣做了比较和评价，最后介绍了IMAC的最新应用及理论模型研究进展。关键词 亲和层析 亲和色谱 金属螯合物固定化金属螯合亲和层析技术研究进展*魏琪 鲍时翔*# 姚汝华(华南理工大学生物工程系 广州 510641 #中国热带农业科学院 海口 571101) 生命科学和生物技术的迅猛发展需要更加高效、可靠的生物大分子分离纯化方法。六十年代出现的利用生物分子间专一、可逆的特异亲和作用的亲和层析技术极大地推动了生物大分子分离纯化工艺的发展1。在生物技术制取蛋白质的多级纯化过程中，高效液相色谱被指定为一个必须步骤，亲和色谱(亦即亲和层析)的选择性和特异性是其它任何技术都无法比拟的。 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念2，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Cu+螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。后来的研究表明经固定的金属离子不仅与基质以螯合形式结合，还可以离子键、共价键形式结合，或分散在固体基质中以胶体状存在。1983年Poroth把凡是固定在基质上的金属(不管是否以离子状态存在)与溶质的亲和作用定义为“固定化金属亲和层析(IMAC)”3。1 基本原理 过度金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力比它们更强时，则蛋白质取代它们金属离子形成复合物，从而使生物分子被吸附。根据软硬酸碱理论，Cu+、Fe+、Co+、Zn+、Ni+等为交界酸，易与组氨酸、色氨酸上的交界碱氧原子和半胱氨酸上软碱硫原子配位结合，而Ca+、Mg+等硬酸则易与磷酰化氨基酸上的硬碱磷原子配位结合。由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属螯和物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。 组氨酸和色氨酸最易与金属离子结合，因此是金属螯合亲和层析中的活性基团。组氨酸上有-氨基、羧基和活性侧链基团咪唑基，它可以由-氨基和羧基与金属离子形成五元环，也可由-氨基和咪唑基与金属离子形成六元环，还可由羧基和咪唑基与金属离子形成七元环。半胱氨酸分子侧链上的硫原子也可与金属离子形成共价键4。 生物分子与金属离子间的结合强度与它们的轨道重叠程度有关，结合作用可分为3种： (1)静电吸引：修饰后的基质带有净负电荷，它可吸附分离表面氨基酸残基带正电荷的蛋白质。 (2)配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基上有咪唑基，其氮原子上的未公用电子对与固定化金属离子形成配位键。 (3)共价键结合：固定化金属离子与蛋白质表面含硫基团作用形成共价键。2 基质 理想的基质(载体、固定相)应具有高度特异性(表面电荷总量接近为零)、高度亲水性(无疏水作用位点)、足够多可利用的化学基团、适当的表面积和孔径、较高的理化稳定性等特点。一般情况下，决定亲和吸附总效率的主要因素是基质的特异性、吸附容量和稳定性，这三个因素的相对重要性依纯化的目的和规模不同而异。 琼脂糖是最常用的基质材料，还有纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂及上述物质的衍生物和共聚物，此外还有大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石等无机材料5。近年来，又出现了以超滤膜或微滤膜为基质的固定化金属螯合亲和膜；最近有报导称用固定化合成多肽的方法制成了生物特异性基质6。3 配基 常用的金属离子配基有Cu+、Ni+、Zn+、Co+等，常用的金属螯合物有亚氨基二乙酸(IDA)、三羟甲基乙二胺(TED)，还有次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基取代天冬氨酸(TEPA)及CMASP、CMDASA等。其中最常用的IDA为优良的螯合剂，其上的一个氮原子、两个氧原子与金属离子螯合后，金属离子上还剩余三个空轨道与蛋白质结合，因此以IDA为螯合剂制成的介质吸附蛋白质能力较大。IDA体积小，与蛋白质结合时空间阻碍较小；IDA具有亲水性，带有二价离子，与金属离子螯合后呈电中性，这使基质与生物分子间的非特异吸附减少到最小程度。4 活化及偶联 常见的活化及偶联方法有溴化氰法、环氧化法、二乙烯砜法、高碘酸盐氧化法等7,8。 由于溴化氰的剧毒性使其应用受到一定限制。最常用的是环氧化法。用环氧氯丙烷活化琼脂糖的同时又使之有一定程度的交联，增加了琼脂糖的机械稳定性和对酸碱、热的耐受性；环氧氯丙烷在碱性条件下易发生水解反应，且沸点不高，后处理容易；价格便宜、毒性低。下图为基质-间隔臂-IDA-蛋白质的立体结构示意图。 图中两个圆形代表水分子配基，另一个水分子配基被蛋白质表面组氨酸的咪唑环取代，适当的间隔臂的加入有利于降低空间阻碍，提高蛋白质的吸附容量。5 洗脱 影响洗脱的因素包括螯合物结构、金属离子结构、蛋白质结构、pH值、缓冲液组成和离子强度等。洗脱方法有以下几种：1. 质子化法：pH值对金属-蛋白质的吸附和解离影响很大。它影响缓冲液中各组分的亲核行为，溶质供电-特性及金属离子的稳定性；高pH值利于蛋白质吸附，低pH值利于解离。根据蛋白质与金属离子的结合力不同，可采用不同的pH值，将吸附程度不同的蛋白质分步洗脱下来。 2. 配基交换法：用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来。这类溶质包括含-NH2、-COOH、-SH等基团的物质和咪唑等取代剂。 此外还有EDTA取代法和离子梯度法。对某些蛋白质的基质有时还需添加修饰剂如尿素、乙醇、乙二醇或去污剂、蛋白变性剂等。 固定化金属螯合亲和层析特异性介于生物特异性亲和层析和低特异性的普通吸附分离如离交层析、疏水层析之间，具有吸附量大，特异性适中，重复使用性好，成本低廉及环境污染小等优点，虽然其特异性比不上生物特异性配基如抗原、酶底物抑制剂等，但通过改善吸附和洗脱条件，也可提高其分辨率9,10。表1 IMAC与其它亲和层析的比较比较参数生物特异性配基金属螯合物配基染料配基特异性高中中结合强度(K1值)高(10-7-10-15)中(10-3-10-6)中(10-4-10-7)偶联方法CNBr法通用环氧基吸附、化学偶联洗脱难易程度难易易吸附容量低高高重复性及稳定性低，配基易阻塞变性高高基质挠性低高高价格高低最低配基泄漏及毒性中到高无到低中到高6 应用 IMAC分离技术由于具有简便、快速、比较专一和高效等特点，已逐渐应用于生命科学的各个领域。提取、分离、纯化、浓缩蛋白质、多肽、核苷酸等各类生物大分子及功能细胞、细胞器和病毒颗粒是其主要功能。1975年，IMAC首次被Porath用于吸附牛血清蛋白，至今人们利用IMAC已成功地分离纯化出了数百种生物大分子。近年来有关这方面的报导在迅速增加。部分最新报导见表2。表2 利用IMAC分离纯化生物大分子生物分子配基基质结果氨基酸Pt+聚丙烯酰胺MetTryTyrHis=Phe牛血清蛋白Pt+聚丙烯酰胺收率60%溶菌酶Cu+微孔玻璃中空纤维12.2g/mlCu、Zn-SODCu+琼脂糖收率63%,纯化60倍2-巨球蛋白Zn+琼脂糖收率60%,纯化34倍1-抗胰蛋白酶Zn+琼脂糖收率22%,纯化29倍-干扰素Zn+琼脂糖收率91.4%人血小板生长因子Cu+、Zn+琼脂糖重组蛋白Cu+、Co+、Zn+、Ni+共聚物收率10.2g/ml合成多肽Cu+、Ni+硅-琼脂糖 根据软硬酸碱理论，IMAC中常用的金属离子配基一般为Cu+、Ni+、Zn+、Co+等交界酸，硬酸如Ca+、Mg+也有应用，软酸因其稳定性和毒性问题较少使用。最近又有报导，Ag+、Pt+也可用于分离生物分子，软酸如Ag+、Cu+、Au+、Hg+、Pb+、Pd+、Pt+、Cd+均可与软碱如含硫官能团的生物分子发生亲和反应，从而扩大了IMAC金属离子配基和目标官能团的范围11。 对表面不含组氨酸或半胱氨酸等氨基酸残基的蛋白质，则可将含有这两种氨基酸或其中一种的多肽接到欲纯化的蛋白质分子上，形成含有该多肽的蛋白质，再将其用IMAC法纯化。His-X3-His片段中，正常折叠的-螺旋结构，被氨基酸分开的两个组氨酸对金属离子有很高的亲和力，测得Cu+-IDA与His-X3-His的结合常数高达106M-1，接近典型的生物特异作用的结合常数。可以利用基因重组DNA技术在目标产物上连接上这个对金属离子有较高亲和力的多肽链，以提高其结合力和分辨率；然后用酶或化学方法将引申的多肽链切除并与目标蛋白分离，从而将目标蛋白纯化，这种分离方法称之为螯合肽固定化金属离子亲和层析(Chelating-Peptide Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography, CP-IMAC)。Reif O.W.用固定化金属离子亲和膜从溶胞产物中成功地分离出了N-末端含组氨酸片段His6的重组体融合蛋白12。 IMAC不仅可用于生物产品的分离纯化，还可用于蛋白质表观结构研究。Hemdend用IMAC做探针，以硫氧还蛋白、泛激素、调钙蛋白、溶菌酶、细胞色素C和肌红蛋白为标准蛋白，探测了它们的表面组氨酸侧链基团的分布，分布不同，与金属离子的亲和力也不同，通过层析就能区别开。金属离子对蛋白质表面组氨酸残基的数量及空间排列的变化很敏感，蛋白质由于部分溶解、折叠不正确或与别的分子结合而引起表面结构的变化都可用IMAC技术来探测。 目前分离纯化生物大分子的方法很多，如高效液相色谱、电泳、萃取、膜分离及离心等。固定化金属的引入对生物大分子的分离纯化提供了又一新的途径。当前生物技术下游加工过程发展的一个重要趋势是多种分离技术的交叉、渗透及融合，形成新的子代技术。近年来，人们结合IMAC选择性较高和膜技术分离快、处理量大的优点，把这两种技术有机地结合起来，研制出了固定化金属螯合亲和膜，这一技术是生物化学、化学工程及生物工程、生物化工等多门学科前沿的交叉点11。7 理论模型 由于亲和吸附、分离过程比较复杂，对其机理了解不多，真正基于物理-化学-生物特异性相互作用的理论模型还未建立，最初基于配基-蛋白质相互作用的吸附-解离平衡过程提出的理论模型有一定的局限性。大多数亲和吸附的理论模型研究集中于单溶质吸附，目前普遍接受的仍是Langmuir模型及其改进型13。 设蛋白质(P)与金属离子配基(以Cu+为例)间为单价(单位点)吸附，则 P + nCu = PCu + (n-1)Cu 达到吸附平衡时得等温方程： 实际情况中均质吸附并不多见。当蛋白质表面组氨酸残基多于一个时，吸附反应涉及蛋白质和IMAC基质的多个位点。此时为非均质(多位点)吸附。较为接受的非均质模型有双参数的Freunlium模型、Temkin模型，三参数的Langmuir-Freunlich模型，四参数的双-Langmuir模型等。蛋白质多位点吸附理论的研究将有助于IMAC分离技术的优化及新型IMAC材料的设计。 Freunlium模型：Q=kFcn Temkin模型：Q=cTln(1+kTc) 双-Langmuir模型： 固定化金属螯合亲和层析作为一种新的分离技术正在兴起和发展，目前仍有许多理论及技术问题需要研究和解决，相信它将成为生物大分子分离纯化的有力工具。符号说明： c: 流动相蛋白质浓度(M) cT: Temkin模型参数 k: 蛋白质吸附表观平衡结合常数(M-1) k1: 单位点吸附平衡结合常数(M-1) k2: 双位点二极吸附平衡结合常数 kA: 蛋白质吸附表观平衡结合常数(强位点)(M-1) kB: 蛋白质吸附表观平衡结合常数(弱位点)(M-1) kF: Freunlich模型参数 n: Freunlich模型参数 Q: 蛋白质吸附容量(m mol/ml 基质) QMAX: 蛋白质吸附最大容量(m mol/ml 基质) QMAX,A: 蛋白质吸附最大容量(强位点)(m mol/ml 基质) QMAX,B: 蛋白质吸附最大容量(弱位点)(m mol/ml 基质)8 参考文献1 Pepper D.S., Molecular Biotech.,2(1994)157-1782 Poroth et al