黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应.doc

黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应化学研究与应用ChemicalResearchandApplieafionvo1.16.No.4Aug.,2OO4文章编号:10041656(2004)04048203黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应刘鑫,李佳,刘克武,黄新河,赵巍(四川大学生命科学学院,四川成都610O64)摘要:从麸醋母曲中分离出黑曲霉Asp5609并以此为诱变出发菌株,采用紫外线照射结合亚硝基胍诱变剂处理,筛选出酸性蛋白酶高产变异株Asp5609.7.用盐溶加温提取法从Asp5609-7固体发酵物料中提取酸性蛋白酶粗酶液,经DC.30型中空纤维柱超滤浓缩,用于食醋酿造物料蛋白的酶解催化,可大幅度提高醋液中氨基酸含量.关键词:黑曲霉;酸性蛋白酶;食醋酿造;催化效应中图分类号:0643.3文献标识码:A蒸酒酿醋在我国至少已有4OOO多年的历史.镇江香醋,山西陈醋,四川阆州醋,被举为当今几大名醋.多年来在消费者的生活中食醋通常仅作调味使用.随着人民生活水平的提高,消费者期望食醋除具备调味功能之外,还应赋予营养保健作用1l.食醋酿造包括酒精发酵,醋酸发酵,后期成熟发酵三个时期.在第三发酵期加入由黑曲霉制备的酸性蛋白酶,有利于催化发酵物料中蛋白质的进一步水解,增加醋液中氨基酸含量,提高其营养价值.1实验部分1.1材料与仪器菌种来源:以本项目组从四川阆州优质麸醋的醋母中分离筛选出黑曲霉菌株(Asperiilus?niger5609,Asp5609)为诱变出发菌株.斜面培养基:察氏培养基;分离培养基:在察氏培养基中加入0.8%的酪蛋白;固体发酵基础培养基;每100g麸皮中加水40mL,添加NH4Cl1.5%,pH_5.5,分装于500mL三角瓶中;液体发酵培养基(%):豆饼粉4.0,玉米粉0.8,鱼粉0.8,Nit4CA1.0,CaCh0.05,K2HPO40.1,豆饼水解液6.0,pH5.5.以上培养基的灭菌条件均为121oC,30rnin.紫外灯(输出电压210V,功率15W);pH计(pSH一3B);紫外可见分光光度计(Uv一752C,上海第三分析仪器厂);超净工作台(SWCJIF,苏州安泰空气技术有限公司);生化培养箱.1.2菌株的诱变处理紫外线诱变处理:用接种环取新鲜PDA斜面上的黑曲霉孢子少许,加入无菌水中进行稀释,用血球计数板进行计数,使每毫升溶液中孢子量约为5000个,取0.1mL涂布初筛平板.30恒温培养4h,让孢子萌发,然后用15w紫外灯照射8rain后(紫外灯与平板垂直距离30em),在黑暗的培养箱中继续培养3d,挑取透明圈大的菌落用作亚硝基胍诱变处理菌株.亚硝基胍诱变处理:用接种环取新鲜PDA斜面上经紫外线诱变处理的黑曲霉孢子少许,加入无菌水中进行稀释,用血球计数板计数,使每毫升溶液中孢子量约为5000个,取3mL孢子悬液,加入等体积的亚硝基胍溶液(3m#mL),充分混合,于30振荡处理1h,取出稀释涂平板,30培养3d,挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验.选育出黑曲霉Asp56097变异株.1.3黑曲霉Asp56097固体发酵条件培养时间60h,前30h30oC,后30h25oC变温培养,培养基pH5.0,培养基持水量50%左右,接种量8%.1.4酸性蛋白酶活性测定用Folin法测定【3J,规定在pH3.0,温度47条件下,每分钟水解酪蛋白产生1/zg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活性单位.Asp56097酸性蛋白酶提取工艺如下:固体发酵捣碎浸提塑压滤墅堕苎塑月且中空纤维柱浓缩一浓缩液体酶制剂图1工艺流程图Fig.1ChartProcessFlow收稿日期120040216;修回日期:2004-O4-15联系人简介:刘克武(1952一),男,副教授,主要研究生物化学与分子生物学.E-mail:liukewuseuyahoo.coin.en第4期刘鑫等:黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应4831.5Asp5609-7在食醋酿造中的催化效应将Asp56097酸性蛋白酶液体酶按5.0%(v/w)的比例加至固体发酵4o天的食醋发酵料中.60天时测定发酵醋液中氨基酸组成,含量及鲜味氨基酸含量(Glu+Asp)和还原糖含量,并与对照比较所产醋液的色泽,品味.2结果与讨论2.1黑曲霉Asp5609诱变结果用紫外灯照射后的菌株涂布平板进行初筛,共挑取6o株;经液体发酵培养基摇瓶复筛得到产酶高的菌株l0株,此lO株再经过固体发酵复筛,其中三株产酶活性较高,其酶活力单位如表1所示.可见,经紫外线照射后酶活最高的菌株w4产酶活性比出发菌株提高了36.5%.表1紫外线变异株产酶活性Table1.Enaymadcaetivity0fstrainsmutatedbyultravioletradiafiOil.选择株用亚硝基胍作进一步诱变处理,由酪蛋白平板初筛得到菌株49株,经摇瓶复筛得到菌株l6株,此l6株再经三角瓶固体发酵复筛.酶活超过2万U/g.干基的菌株有5株,其中两株产酶活性最高,分别为w4.7株35240U/g.干基,UV4.13株30851U/g.干基.亚硝基胍诱变后酶活最高的变异株-7比紫外线照射后的变异株酶活提高88.6%,比出发菌株提高1.6倍.选择.7进行后续试验,并将其命名为Asp5609-7.2.2AsD5609.7酸性蛋白酶的提取蛋白酶是生物大分子,其催化活性受多种因素的影响,如提取时间,提取温度,提取溶剂及pH等.为尽量减少酶活损失,提取时应使酶最大限度地溶解于提取溶剂中;同时,在提取过程中既要保证有足够的浸泡时间又要防止时间过长导致一些重金属离子使酶蛋白中的一SH被氧化而使酶活下降甚至丧失引.向发酵物料中加入4o,0.1mol/LNaC1溶液,用胶体磨磨浆,袋装压滤制得粗酶液.此方法抽提完全,重复性好,耗时短,简便,易行.采用新型Bs一大孔弱碱阴离子交换树脂分离粗酶液.该树脂交联度小,孔隙大,以利于大分子物质渗透入网孔中进行离子交换反应.BS型大孔弱碱阴离子交换树脂交换容量4.2mmol/g(干),粒度0.31.21Tim,湿度密度1.051.15(20),含水量6070%,最高使用温度100(C1)使用pH范围09,是一种适用于分离酶蛋白的新型树脂.通过多次实验摸索,得到了最佳的上柱及洗脱条件.选用DC一30型中空纤维超过滤系统浓缩经树脂分离的酸性蛋白酶液,在滤掉无机盐及部分小分子物质的同时,可使粗酶液浓缩46倍,酸性蛋白酶回收率达到91.9%,获得99674U/mL的高活性液体酸陛蛋白酶.采用中空纤维柱超滤浓缩技术在常温下浓缩粗酶液,解决了蛋白酶在工业化浓缩中易失活,回收率低的难题.此技术使液体酸性蛋白酶的回收率比膜式长管蒸发器浓缩技术提高20个百分点.2.3Asp56097产酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应酿造食醋以含淀粉多的麸皮,玉米等为原料,其中也有蛋白质成分.这些蛋白质经蒸熟后,由曲霉所分泌的蛋白酶催化,在糖化,酒精发酵及醋酸发酵各阶段中,逐渐分解成各种氨基酸及其中间代谢产物.但仅利用曲药中微生物所产蛋白酶还不能充分水解原料中的蛋白质.考虑到食醋酿造后期发酵物料pH值偏酸性,而且随着醋酸的增加pH值还会继续降低.而该pH值范围正好是酸性蛋白酶作用的适宜pH值,所以在酿醋后期直接添加酸性蛋白酶制剂有利于提高原料中蛋白质的水解率并进一步提高醋液中氨基酸含量.食醋中的谷氨酸和天门冬氨酸是食醋鲜味的主要成分(称为鲜味氨基酸),酪氨酸是食醋部分色素生成的分子基础.由表2可知,经过酸性蛋白酶的催化,醋液中氨基酸含量大大增加的同时鲜味氨基酸和还原糖的含量也显着增加.在食醋发酵后期添加黑曲霉酸性蛋白酶制剂,对提高食醋的营养价值,鲜味,色泽和L-q感均有重要作用.表2添加酸性蛋白酶制剂后醋液中氨基酸含量对比表未加酶制剂2294.8加5.O%液体酶制剂3426.3496.1709.98.3511.84棕红色酸味柔和,鲜味不足棕褐色味鲜回甜,芳香浓郁化学研究与应用第16卷在相同发酵条件下,添加酸性蛋白酶制剂比未添加多产醋液10%.每100mL醋液中氨基酸含量增加49.3%,鲜味氨基酸含量增加43.1%.添加酸性蛋白酶制剂发酵食醋与市售同类产品的氨基酸指标比较见表3.表3中国名醋氨基酸成分对比表Table3,compositionofamino-acidinfamousChinesevinegar由表2可见,将黑曲霉酸性蛋白酶制剂加入食醋后期发酵物料中,其产品中总氨基酸和鲜味氨基酸含量均比未加酶制剂高.由表3可见,加酶制剂发酵后,四川阆州醋的氨基酸含量为3426.3mg/100mL,未加酶制剂发酵的山西老陈醋参考文献:1诸亮,袁耕瑾.发酵调味品生产技术.北京:中国轻工业出版社,2OO2,289290.【2黄遵锡,慕跃林,周晶.粮食与饲料工业,1999(3):27293邬显章.酶的工业生产技术.吉林:吉林科技出版社,1988氨基酸含量为2271.0mg/100mL,镇江香醋为116.8Ill()on1I.鲜味氨基酸(Asn+Glu)含量,四川阆州醋是709.9m#100mL,山西老陈醋是454.5mg/100mL,镇江香醋仅为179.9mg/100mL.4费笛波,钱玉英,叶玲玲,等.浙江农业,199r7,9(6):300304.5张树政.酶制剂工业,第三版.北京:科学出版社,1998:387394.6Lyo,rip.Milling,1988,181(2):2428.Catalyticeffectofacidproteinasefromasperillusniger56097onthevinegarbrewingLIUXin,LIJia,LIUKeWU,HUANGXinhe,ZHAOWei(CollegeoflifeScience,SichuanUniversity,Cllengdu610064,cIliIla)Abstract:Asperillusniger5609wasisolatedfromvinegarfermentationmediamandmutatedasstarringswain.MutantAsp56097withhighproductionofacidproteinasewasobtainedbyultravioletradiationof15Wandtreatmentwithnltrosoguanidine.CoarseenzymeliquidfromsolidcultureofAsp56097wasprepbysaltdissolvingwithtemperature-increasing.Condensatebysuper-filtrationwithho