维生素的荧光光度法测定.doc

仪器分析实验 教案实验题目：维生素的荧光光度法测定教学目标：1、 学习和掌握荧光光度分析法测定VB2的基本原理和方法2熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法。教学重点：掌握荧光光度计的工作原理和操作方法。教学难点：了解荧光光度计的操作程序。仪器药品： 荧光光度计,维生素B2标准品，维生素B2药片,HAc。教学方法： 讲授、演示教学时数： 4学时教学过程： （教师授课思路、设问及讲解要点）一、实验原理荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。 既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关关系。由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。 对同一物质而言，若abc1（0.05或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系： F=2.303f I0 a b c 式中：f荧光过程的量子效率；I0入射光强度；a荧光分子的吸收系数；b试液的吸收光程。I0 和b不变时：FKC 式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。VB2(即核黄素)在430440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH = 67时最强，在pH = 11时消失。二、实验步骤1标准系列溶液的配制在五个干净的50mL容量瓶中，分别加入1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL和5.00 mL VB2标准溶液，用H2O稀释至刻度，摇匀。2标准溶液的测定设置适当的仪器参数(如Data Mode = Fluorescence， 激发波长 = 435 nm，发射波长 = 525 nm)，用蒸馏水作空白，清零。然后，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。3未知试样的测定取待测液2.50 mL置于50mL容量瓶中，用H2O稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。三、数据处理项目参比液012345待测液6(经稀释)加入VB2标准溶液体积/mL1.002.003.004.005.00加入VB2待测液体积/mL2.50用H2O稀释定容，摇匀，测定 (VB2) /mgL-10.0000.2000.4000.6000.8001.0000.470荧光强度(F)045.05583.859125.935166.844210.02798.7611用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线如图1。2根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度(VB2) = 0.470 mgL-1，则原待测液的浓度(VB2) = 0.470 mgL-1 = 9.40 mgL-1。 由上可知，药片中VB2含量为9.40 mg片-