实验六-果蝇的有性杂交(设计性实验).doc

实验六 果蝇的有性杂交（设计性实验）一、实验目的本实验在完全开放的状态下进行，学生处于主导地位，通过小组讨论的方法，自己选择实验组合，提出实验设计方案，独立完成实验内容；教师只是起协助作用。通过实验验证遗传学的三大定律：分离规律、自由组合规律和连锁互换规律（伴性遗传），比较正反交在F1及F2代之间的差异。掌握果蝇杂交的实验技术，运用生物统计方法对实验数据进行分析，并计算遗传图距和基因排列顺序。要求学生在一段时间内安排好实验进程，如实记录实验中出现的现象和问题，并做出自己的判断。二、实验原理遗传是极其复杂的生命现象，只有通过少数相对性状有差异的类型进行杂交，观察这些性状在亲本和子代中的表现，并对大量材料进行分析才有可能找到或验证性状遗传的基本规律。1关于分离规律（law of segregation）生物体一对相对性状的遗传行为符合孟德尔的分离规律。一对等位基因在杂合状态中（A/a）保持相对的独立性，减数分裂形成配子时，随同源染色体的分离而彼此分离、分配到不同的配子中，配子只含有成对因子中的一个。各种雌雄配子受精时随机结合，因此，等位基因杂合体的自交后代基因型分离比AA : Aa : aa是1 : 2 : 1，如果显性完全，其表型分离比为3 : 1。等位基因的显隐性决定其性状表现。通过果蝇一对因子的杂交或测交实验，即可以验证分离规律。现以果蝇的长翅和残翅性状的遗传规律举例说明（见下图）。2关于自由组合规律（law of independent assortment）两对或两对以上的位于非同源染色体上的非等位基因的遗传行为符合孟德尔的自由组合规律（独立分配规律）。在减数分裂形成配子的过程中，位于不同对染色体上、控制不同相对性状的等位基因随着同源染色体的分离和非同源染色体的自由组合一起进入不同配子。也就是说非等位基因独立行动，可分可合，有均等机会组合到同一个生殖细胞中。受精后，配子之间随机自由结合，导致了基因的重组，后代出现亲代所没有的性状，也就是变异。以两对独立基因为例，它们所决定的性状，在F2代呈现9 : 3 : 3 : 1。现以果蝇的长翅/残翅性状及灰体/黑檀体体这两对独立性状的遗传规律举例说明（见下图）。3关于连锁遗传（linkage）1901年贝特生等在做香豌豆的杂交实验时发现，花色和花粉粒形状这两对性状的遗传不符合自由组合规律。后来摩尔根和他的学生利用果蝇做实验，创立了连锁交换定律。许多非等位基因位于同一染色体上，这样的基因控制的性状在形成配子时倾向于连在一起传递，称为连锁；而同时，非姊妹染色单体间交换也会形成交换型配子，称为交换。连锁和互换是生物界的普遍现象，也是造成生物多样性的重要原因之一。完全连锁只产生比例相同的亲本型配子，与一对基因的遗传很相似，较为罕见。不完全连锁的F1代不仅产生亲型配子，也产生重组型配子。一般而言，两对等位基因相距越远，发生重组的机会越大，即重组率越高；反之则反。故重组率可用来反映同一染色体上两个基因之间的相对距离，重组率为1%时两个基因间的距离记作1厘摩（centimorgan，cM）。计算公式：重组率（RF）（）重组型的配子数/总配子数100。存在于同一染色体上的基因，组成一个连锁群。把一个连锁群的各个基因之间的距离和顺序标志出来，就能绘成连锁遗传图。利用重组率确定连锁基因间相对位置和距离的方法可分为两点测验和三点测验。两点测验（two-point test cross）是将双因子杂合体用双隐性纯合体测交。但两点测验工作量大（确定三个连锁基因的位置需做三次杂交，三次测交），不能排除双交换的影响，有时准确性不够高。三点测验（three-point test cross）是利用三因子杂合体的测交后代检测基因间的连锁关系和估计连锁基因间的遗传距离，可以发现基因间的双交换。每次测验两对基因间的重组率，并根据三个遗传距离推断三对基因间的排列次序。对于去雄较困难的植物（水稻、小麦、花生、豌豆）也可以用自交法测定重组率。每发生一次单交换，它临近也发生一次交换的机会就减少一些，即发生干涉。一般用并发率表示干涉的大小：并发率观察到的双交换的频率/两个单交换频率的乘积。本实验通过对果蝇同一染色体（X）上三个非等位基因（白眼、小翅、焦刚毛）的交换行为来验证基因在染色体上呈直线排列（见下图）。先将野生型果蝇与三隐性果蝇的制成三因子杂种，再把雌性杂种与三隐性个体测交，在测交后代中由于基因间的交换可得到种不同的表型，经过数据处理，一次实验便可测出三个连锁基因在染色体上的距离和顺序，还可计算出双交换值及并发率。4关于伴性遗传（sex-linked inheritance）雌雄性别是生物界最普遍、最引人注意的现象之一。细胞核内，直接与性别决定有关的一对染色体称为性染色体，其余统称为常染色体。动物性染色体类型主要分为XY型和ZW型，其中以XY型较为普遍，人类和果蝇都属于这种类型。由于形态、结构和大小有明显差异，两条不同的性染色体只有一部分是同源的，遗传行为与常染色体相同。而其余部分的非同源染色体之间无配对关系，无功能上的联系，它们所控制的性状称为伴性性状，这些性状的遗传因与性别相关联，故被称为伴性遗传或性连锁遗传。伴性遗传现象是摩尔根在果蝇的杂交试验中首次发现的。果蝇的红眼和白眼是一对等位基因。在试验中，将一只白眼雄蝇与红眼雌蝇交配，F1都是红眼类型，说明红眼对白眼是显性。让F1互交，F2中所有雌蝇均为红眼，而雄蝇则一半为红眼，一半为白眼。如以白眼雌蝇与红眼雄蝇交配，F1中凡是雌蝇均为红眼，雄蝇均为白眼，F2中不论雌蝇或雄蝇，均有半数为红眼，半数为白眼。这说明，雄果蝇的眼色性状跟性别有关，白眼突变基因位于X染色体上，并且是隐性的，通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇，Y染色体上不含有它的等位基因（见下图）。测交实验也同样可以证实上述的分离比例。现已查明，果蝇X染色体上有140多个基因属于伴性遗传。5关于适合度在遗传实验中，实际统计数字与预期理论值之间总是存在误差的，而判断该误差是由于群体小而产生的机会偏差，还是遗传原因造成的本质差异引起的，就要进行适合度测验。遗传学中用卡平方（2）来测定适合度。具体做法如下：首先设立无效假设，即误差是由机会效应造成的，然后由此推求由机会造成该误差的概率（P）：计算卡平方值： （O：实际观察数；e：期望值；：累加符号）确定自由度：子代分离类型数减1，如果自由度1，上述公式变为：最后，根据查表求得20.05/0.01（P0.05/0.01）（见下表），通过比较2与20.05/0.01值大小，判断是否接受无效假设：若2220.05，差异显著，否定无效假设；若220.01，差异极显著，否定无效假设。自由度（df）P0.990.950.500.100.050.011.000160.00390.452.713.846.6420.02010.1031.394.615.999.2130.1150.3522.376.257.8211.3540.2970.7113.367.789.4913.2850.5541.1454.359.2411.0715.09三、实验药品、仪器及用具药品：乙醚、酒精、丙酸、酵母粉、琼脂、玉米粉、白糖。仪器及用具：生化培养箱、双筒解剖镜、镊子、不锈钢锅、电磁炉、电热恒温干燥箱、培养瓶、脱脂棉、烧杯、玻棒、毛笔等。四、实验材料黑腹果蝇品系：18、2、6、16、22、e。野生型果蝇的双翅是长翅（翅长过尾部），红眼（复眼红色），灰体（身体灰褐色），直刚毛；各突变性状描述见下表。本实验所有野生性状对隐性性状显性完全。突变名称基因符号性状特征在染色体上的座位白眼（white eyes）w复眼白色 X1.5黑檀体（ebony body）e身体呈乌木色，黑亮。 III R70.7黑体（black body）b体黑色，比黑檀体深。 II L48.5残翅（vestigial wings）vg翅明显退化，部分残留，不能飞。 II R67.0小翅（miniature wings）m翅膀短小，不超过身体。 X36.1焦刚毛（singed bristles）sn刚毛卷曲如烧焦状 X21.0五、实验步骤1分组讨论，设计实验方案，并交由教师修正。可尝试各种杂交组合，每种组合不一定只局限于验证一个定律。2配制培养基。3选处女蝇。为了操作方便，可提前处理培养瓶内的成蝇，8 h后对新羽化的果蝇进行挑选，并用麻醉的方法将雌雄个体分开培养，以备杂交之需。4配制杂交组合，每个组合雌（处女蝇）雄果蝇各一只放入培养瓶内，并在瓶上贴好标签，注明杂交内容、日期、实验组号等，然后将培养瓶放入25培养箱内培养。必要时可设置反交和重复。57天后，当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本处死以防发生回交。F1个体出现后，观察其表型，注意显、隐性关系并计数统计。6在一个新的培养瓶内放入1对F1（、）配成F1F1。如果进行测交，则需选择隐性亲本与F1杂交。也可以自交和测交同时进行，互相验证。7第二代果蝇出现后，根据不同的性状进行观察统计，每个组合适宜观测数目为200300只。注意：无论是对F1还是F2的统计都要及时进行，避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾。因此要求实验者不断观察，只要有新羽化的的果蝇就要及时取出。【表格设计模式】：学生可根据实验情况自行设计表格。例表：三点测验实验结果测交后代表型测交后代基因型观察值期望值重组发生在w-snsn-mw-m红长直+白小焦wmsn白长直w+红小焦+msn红长焦+sn白小直wm+红小直+m+白长焦w+sn总计重组值2六、作业及思考1. 仔细观察杂交过程中