gateway技术.doc

Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。图1 Gateway技术的灵活性下载 (41.22 KB)6天前19:23Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。Gateway技术是基于已研究的非常清楚的噬菌体位点特异重组系统（attB x attP attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。表1 反应和术语总结反应反应位点产物产物结构BP反应attBattP入门克隆attL1-基因-attL2LR反应attLattR表达克隆attB1-基因-attB2图2 Gateway技术总结下载 (22.19 KB)6天前19:23Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体BP重组）（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体（3）使用pCMV?SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库（4）Gateway改造过的克隆资源* 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组通用M13位点便于测序基于pUC的ori位点提供高产量质粒大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较 入门载体特点优点pENTR/D-TOPO无SD（Shine-Dalgarno）位点真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达pENTR/SD/D-TOPO含SD（Shine-Dalgarno）位点包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达图3 Gateway定向TOPO克隆下载 (27.46 KB)6天前19:23Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客四、构建入门载体的各种选择1、限制性内切酶消化作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个 Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。2、PCR重组克隆重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体（包含attP位点）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何 Gateway目的载体进行重组（参看图2）。3、Gateway改造过的cDNA文库如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。SuperScript cDNA文库使用pCMVSPORT构建，有几种人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。4、入门克隆的切入点克隆资源您可以从与10000个人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70%以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术、oligo dT引物以及SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGen库或UltimateORF库。克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。图4 进入Gateway系统的各种路线下载 (34.6 KB)6天前19:23Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组五、触手可及的最高级表达系统一旦您构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。图5 在Gateway系统表达全长开放阅读框下载 (40.89 KB)6天前19:23Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞（杆状病毒）或大肠杆菌BL21-SI菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达。在Hartley， J.L.et al. (2000) Genome Research 10(11):1788-95 可以找到更多的细节。为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论您选择哪个系统体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物都可以获得Gateway目的载体。