质粒DNA的提取、酶切及目标序列的PCR扩增.doc

*大学教学实验报告 实验项目名称：质粒DNA的提取、酶切及目标序列的PCR扩增实验项目性质： 综合性实验计 划 学 时： 课程实习班 级： 姓 名： 学 号： 指 导 教 师： 2010 年 5 月26日摘 要本实验通过碱裂解法提取并纯化大肠杆菌DH5（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）中的质粒DNA，并对该质粒DNA进行双酶切及目标序列的PCR扩增，学习并掌握基因工程操作中最常用的载体质粒DNA提取方法及其纯化技术、DNA酶切分析实验的基本操作和PCR实验操作技能，理解限制性内切酶的特点，加深对聚合酶链式反应的原理的理解。结果显示，提取的质粒DNA量较多，且含有插入目的片段，但仍伴有大分子DNA碎片，提取纯化质粒DNA的操作有待提高。本文为基因工程中质粒DNA提取和纯化等提供一定的参考价值。关键词：质粒DNA 双酶切 PCR1、 前言质粒 ( Plasmid)是一种染色体外稳定的遗传因子，大小从 1200 kb不等，为双链、闭环的 DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力1，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达，是分子生物学试验中常用的工具2。质粒DNA 是基因工程的常用载体。大肠杆菌因其易操作，发酵周期短，备受分子生物学工作者的青睐。因此，大肠杆菌质粒DNA 的提取成为分子生物学实验中最基础和最重要的工作。质粒的质量关系到分子克隆的全过程。目前 ,常用的质粒提取方法除了有碱裂解法3-4、煮沸法等，还有许多改进的方法报道(如贺竹梅5、李云峰6等)。同时各试剂公司也开发出多种质粒提取试剂盒。本文以碱裂解法提取质粒DNA并进行纯化，分别以双酶切与PCR技术检验提取的重组质粒中是否含有插入的目的片段。2、 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验材料大肠杆菌DH5（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）2.1.2 实验试剂LB培养基，3mol/L醋酸钾（pH5.2），TE缓冲液（pH8.0），无水乙醇，75%乙醇，RNaseA（10mg/ml），goldview DNA染色剂，氯仿，琼脂糖；BamHI（1 U /L）、Hind（1 U /L）、10K buffer、6上样缓冲液、0.5TBE等；1U/L的 Taq酶，10 PCR buffer，1 mmol/L 的dNTP，克隆基因特异引物F1、F2（各1mol/L），marker DNA，ddH2O。l 抽提质粒DNA所需的溶液：溶液：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用；溶液：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；l 电泳缓冲液（0.5TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；l PCR扩增引物：PF：5CCAAATGGTTGTATGGTGTT3PR：5CTATCCAACAATCTTGGAAA32.1.3 实验仪器高压灭菌锅，超净工作台，恒温摇床，台式离心机，涡旋振动器，培养管，移液器，1.5ml的离心管，吸管头， 0.2ml的PCR管，PCR仪，冰盒，量筒，制胶模，电泳仪，紫外观测仪等。2.2 实验方法2.2.1 碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化（1）质粒DNA的提取： 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37振摇培养过夜； 取1mL菌液放入1.5mL Ep管中，5000 r/min（简写rpm）离心2min；弃尽上清； 加入150L预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀，悬浮菌体； 加入250L的溶液，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌； 加入180L的溶液，温和混匀，80放置5min； 12000rpm离心8min； 吸上清550L至另一新的1.5mL EP管，加等体积氯仿充分混匀，12000rpm离心5min； 小心移取上清液150L至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-80静置10min，12000 rpm离心5min，弃上清； （静置期间制1%琼脂糖凝胶） 加入300L 70%乙醇洗DNA沉淀，弹离心管壁至DNA沉淀悬浮，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心1min，用移液器尽可能除去乙醇，通风橱适度风干； 加入30L RTE （含20g/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA， 37放置1h； 取10L质粒DNA溶液于另一干净离心管中，2L上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中； 打开电源开关，调电压为80100伏进行电泳； 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。（2）1琼脂糖凝胶的制作：以制30mL量的琼脂糖凝胶为例，具体过程如下： 称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中； 加入30mL 0.5TBE于三角瓶中，称出总重量并记录； 在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量； 室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，此时再加入1.5L goldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5L)，混匀； 把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固（一般需要20分钟以上）； 小心拔掉梳子，把凝胶连同胶膜一起转移到电泳槽中（TBE缓冲液的添加以没过胶面12毫米为宜），即可用于点样和电泳检测。2.2.2 质粒DNA的双酶切分析（1） 在一1.5mL离心管中配制质粒双酶切反应液：（反应体系为20L）各成分如下：质粒DNA 10L10Buffer 2LBamHI（1U/L） 1LHind（1U/L） 1LddH2O 补水至20L用移液器tip头轻轻混匀（2） 30恒温条件下酶切反应约2h （酶切过程中，制备1的琼脂糖凝胶）；（3） 酶切结束后，往酶切反应管中加入4L 6上样缓冲液，轻轻混匀；（4） 取全部酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5L标准分子量 marker DNA；（5） 接通电源，调电压8090伏开始电泳，电泳持续约3040分钟；（6） 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果；2.2.3 聚合酶链式反应（PCR）（1） PCR反应液配制：反应体系为25L （请先计算出如下各成分所需加入的量） 反应液组分起始浓度25L反应体系所需量反应buffer102.5LdNTP mix1mmol/L2L引物F11mol/L2L引物F21mol/L2LDNA模板提取的质粒取质粒DNA提取中步骤10中的质粒DNA溶液1LTaq酶1U/L1L无菌水H2O补水至总体积25L，混匀盖上盖（2） 在PCR仪中运行如下PCR反应程序，实现DNA的扩增：90 30min90 30s48 40s72 1min72 10min 20循环 （3）PCR扩增过程中，制备1的琼脂糖凝胶；（4）PCR结束后加入5L上样缓冲液，混合均匀并全部上样于1琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5L marker DNA做标准分子量大小对照；（5）接通电源，调电压8090伏开始电泳，电泳持续约3040分钟；（6）切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果；3、 结果与分析3.1 质粒DNA提取3.1.1 由图1可见，质粒DNA电泳结果有以下情况： 没有带出现：这有两方面的原因，一是质粒DNA并没有提取出来，二是质粒DNA提取出来了。前者是可能是由于溶液、的加液顺序颠倒使得大肠杆菌细胞没有裂解，或者是洗涤沉淀时洗去了质粒DNA。后者可能是由于点样时，枪头刺穿了琼脂糖凝胶，使得质粒DNA流失。 点样口出现绿色这是由于提取质粒操作中加入溶液和溶液时，混匀不够温和，使得部分染色体DNA由于机械损伤断裂成大分子碎片，离心不能完全去除，最后电泳时点样口出现绿色。 条带下端出现黄色这可能是由于提取的质粒DNA中存在污染物而导致。 条带出现拖尾现象这是由于提取质粒操作中加入溶液和溶液时，混匀不够温和，使得DNA由于机械损伤断裂成大分子碎片，部分质粒被降解。 电泳上端出现三条带，顺着电泳方向分别为开环、线状、超螺旋三种构型质粒DNA。 电泳最下端出现较宽的较弱带这是RNaseA与RNA反应不完全，使得部分RNA残留。3.1.2 图1中的红色方框内为本实验结果，出现情况、的现象。电泳结果出现3条带，其中一条圆头清晰亮带，两条较弱带，表明提取的质粒DNA绝大部分为超螺旋结构，质粒DNA质量稳定，结果重复性好，样品浓度较高，但存在基因组碎片和RNA残留，质粒DNA提取操作有待提高。图1 质粒DNA提取的琼脂糖凝胶电泳3.2 质粒DNA双酶切与PCR扩增图2 质粒DNA的双酶切与PCR鉴定3.2.1 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。限制性内切酶活性与DNA的浓度、DNA的甲基化程度、温度、缓冲液等有关。而PCR产量、质量则与Taq酶、dNTP的浓度、模板的纯度及使用量、引物浓度、Mg2+浓度、PCR反应程序设定等有关。3.2.2 由图2可见，PCR扩增带与双酶切分析存在以下情况：（1） PCR扩增： 只有一条目的扩增带，这是目的片段扩增带。 在2000bp上端出现12条带，这是模板，可能是由于模板浓度较高或者提取得到的质粒DNA浓度较高，影响PCR扩增结果。 在100bp左右出现一条较宽的较弱带，这是未被使用的RNA引物或者引物二聚体。（2） 双酶切分析： 没有条带 在2000bp上端出现12条带，这是由于加入限制性内切酶量不多，质粒DNA没有完全反应，而剩余的完整质粒和现形质粒。 在500bp处出现目的片段条带。 在100bp左右处出现一条较宽的较弱带，这是没有反应完全的限制性内切酶。3.2.3 图2中红色框内为本实验结果，PCR鉴定结果在500bp处出现一条明显扩增条带，PCR扩增目的片段产物浓度较高，而双酶切分析则出现情况、，目的片段条带较弱，这可能是由于酶切反应时间不足，或者双酶切反应液混合不均匀，使得双酶切反应不完全，使得目的片段浓度较低。PCR扩增和双酶切分析结果显示，所提取的质粒DNA浓度较高，且含有插入的目的片段。4、 讨论质粒DNA提取是基因工程的基础。所有分离质粒 DNA 的方法都包含3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA。在碱性条件下，双链DNA氢键断裂，结构被破坏而变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去，而质粒DNA则留在上清液中，用乙醇等沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。使用碱裂解法提取质粒DNA，操作简单，所得质粒量大污染较少，但是花费的时间较长。参考文献1 Frederick，M. Ausubel . Short p rotocols in molecular biologyM.北京：科学出版社，1999. 17-19.2 孙树汉. 基因工程原理与方法 (第一版) M. 北