猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳.docx

一、 原理1. 超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。SOD催化下述反应：2H+2O2- H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量相对的平衡。机体内的O2-形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为 H2O2和O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。2. 有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理：亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。3. 邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生O2-，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在34 min内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率，在325 nm波长处测定吸光度值即可。4. 蛋白质含量测定样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250）在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595 nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在11 000 g。5. SOD同工酶分离鉴定SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素（FAD）经光照所产生的O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD出应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的种类数量、分子量大小分布及活性大小）。二、 操作步骤1. SOD的提取1 取新鲜猪血20ml于50ml离心管，6000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。2 向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（样1）。然后将清液在65-70恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样2）。3 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，6000r/min，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，溶于3 ml蒸馏水，备用（样3）。2. SOD活力测定1 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2 ml蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20 min，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 mmol/L HCl作空白，325 nm波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。2 酶活力测定样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与1基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。3 酶活性单位计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：单位活性（U/ml）= (Ao-Am)/A0100%50% 反应液总体积数样液稀释倍数样液体积其中，Ao为邻苯三酚自氧化率；Am加酶后邻苯三酚自氧化率。总活性(U)单位活性酶原液总体积4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）： 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂试管编号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250（ml）55555蛋白质含量（g）020406080100盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10分钟，在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取3支试管，分别加入50l、100l、100l的样1、样2和样3，再分别加入950l、900l和900gl蒸馏水，3支试管中都加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(g)，计算其浓度。5 结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。比活力（U/mg）=单位活力（U/ml）单位蛋白质浓度（mg/ml）=总活力（U）总蛋白质（mg）将测得的数据或计算结果填入下表：提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性U/ml总活性U比活性U/mg回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的3. SOD同工酶鉴定（聚丙烯酰胺凝胶法）1 样品制备取一定浓度（约SOD 0.5mg/ml）酶液，酶液与40%蔗糖按1：1的体积比例配成样品液，备用。2 制备凝胶(1)用蒸馏水清洗两块玻璃板，两条玻璃间隔条和一把梳子，凉干备用。(2)组装玻璃板。平放大玻璃板，盖上有凹槽的小玻璃，用4个蝴蝶夹左右两边夹住玻璃的两条边固定这个组装系统，左右两边封到34 cm高即可。(3)配胶。取两只洁净的小烧杯、标号，按下述试剂配方：试剂分离胶 浓缩胶30%Acr-Bis（ml）2.00.4Tris-HCL PH8.9缓冲液（ml）1.5Tris-HCL PH6.7缓冲液（ml）0.5H2O（ml）4.51.510%AP（ml）0.150.075(4)灌胶。混合好胶液，应马上进行灌胶。左手扶住组装好的玻璃板，45度倾斜，凹形的小玻璃板朝上，右手将烧杯中胶液从凹口夹逢中均速灌入，待满至离玻板口4cm左右停止灌分离胶。加蒸馏水水压线，当界面开始出现明显的分隔线的时候，将水倾倒出，用滤纸吸干水分（注意不要损坏胶面）。将配好的浓缩胶按照同样的方法匀速均匀倒入，满至从顶部溢出，水平插入梳子，梳子的深度约1 cm为好，过深，取梳子时容易损坏胶孔；过浅，上样量受限制。注意：灌胶和插梳子时应避免产生气泡。气泡将严重影响凝胶的质量，继而影响实验结果。(5)静置凝胶30 min完成聚合反应。(6)清理玻璃凝胶板。小心取出梳子，去掉透明胶和4个蝴蝶夹，清洗玻璃板周边的碎胶，最后蒸馏水冲洗一遍后吸水纸擦干。此步操作应避免挤压玻璃板使胶变形。3 上样(1)把清理好的玻璃凝胶板插入双垂直电泳槽，大玻璃面朝外，凹形的小玻璃朝里，分别用4个蝴蝶夹将玻璃凝胶板固定在电泳槽上。第二张胶板的装法与第一张一致。如电泳槽只跑一张胶，则只需把大玻璃固定在另一边，形成装缓冲溶液的上槽即可。(2)在电泳槽的上、下槽中加入电泳缓冲液，上槽的缓冲液加至淹没凝胶15cm，下槽加至没过底边玻璃15cm ，观察上槽是否漏液，如果漏液，必须重新组装。4 电泳当指示剂溴酚兰离下边缘还有1cm的时候停止电泳，下胶染色。5 取出胶板显带用硬质卡片揭去一块玻璃板，另一块板上的凝胶面倾斜，沿着凝胶一角注水，将胶版冲入培养皿，充分展开。倒入NBT溶液，严格避光浸泡20min，再放在2.8ml/L的EDTA-Na2溶液中，放置在日光下照射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，观察结果，拍照绘制模式图。三、 结果1. SOD活力测定将含有SOD的样1、样2及样3加入邻苯三酚自氧化过程的反应液中，记录加样体积及每30 s观察的吸光度值，与邻苯三酚自氧化率测定过程吸光度值同记录与下表：计时吸光度值A325邻苯三酚自氧化加SOD后的邻苯三酚自氧化样1a样2b样3c00:00:000.0120.024-0.0390.03400:00:300.0450.031-0.0340.05100:01:000.0830.040-0.0280.06800:01:300.1240.050-0.0220.08500:02:000.1630.058-0.0170.10100:02:300.2010.067-0.0120.11600:03:000.2370.076-0.0070.13200:03:300.2700.084-0.0010.14700:04:000.3020.0930.0000.161a 样1为除去变性蛋白沉淀物后的上清液，加样体积为50 l；b 样2为热处理后除去沉淀物得到的上清酶液，加样体积为100 l；c 样3为加丙酮后沉淀物溶于蒸馏水而得的溶液，加样体积为100 l。根据公式：单位活性（U/ml）= (Ao-Am)/A0100%50% 反应液总体积数样液稀释倍数样液体积邻苯三酚自氧化率A0=（0.302-0.012）/4 min=0.07250 min-1加入样1、样2和样3后邻苯三酚自氧化率Am分别为：A1=（0.093-0.024）/4 min=0.01725 min-1A2=（0.000+0.039）/4 min=0.00975 min-1A3=（0.161-0.034）/4 min=0.03175 min-1反应液总体积都为10 ml，即反应液总体积数均为10；样1、样2和样3均未稀释，即样液稀释倍数都为1。因此，样1、样2和样3中SOD单位活性分别为：b1= (0.07250 min-1-0.01725 min-1)/0.07250 min-1100%50% 10150l=304.873U/mlb2= (0.07250 min-1-0.00975 min-1)/0.07250 min-1100%50% 101100l=173.103U/mlb3= (0.07250 min-1-0.03175 min-1)/0.07250 min-1100%50% 101100l=112.414U/ml样1、样2和样3的酶液总体积分别为V1=10.0 ml、V2=9.5 ml和V3=8.5 ml，故其酶总活性分别为：c1=b1V1=304.873 U/ml10.0 ml=3048.276 Uc2=b2V2=173.103 U/ml9.5 ml=1644.483 Uc3=b3V3=112.414 U/ml8.5 ml=955.517 U以除去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）中活性SOD的回收率为k1=100%，按酶总活性的大小计算各过程中SOD的回收率，则样2和样3的回收率分别为：k2= c2 / c1=1644.483 U/3048.276 U=53.95%k3= c3/ c1=955.517 U/3048.276 U=31.35%2. 蛋白质含量测定蛋白质含量与吸光度值A595的标准曲线测定值如下表：蛋白质含量（g）020406080100吸光度值A5950.0000.2940.3140.4020.540.672 去掉偏差较大的点（0.294，20g）后标准曲线拟合如下图：蛋白质含量/gA595样1、样2和样3的加样量及吸光度值记录于下表：样品号加样量/l吸光度值A595重复重复样1250.3040.341样21000.1500.145样31000.0480.054因此，样1、样2和样3中蛋白质含量分别为：d1=0.304+0.341/2146.5840 g25l=1.8903 mg/mld2=0.150+0.145/2146.5840 g100l=0.2162 mg/mld3=0.048+0.054/2146.5840 g100l=0.0748 mg/ml所以，样1、样2和样3的比活力分别为：e1= b1/d1=304.873 U/ml1.8903 mg/ml=161.2048 U/mge2= b2/d2=173.103 U/ml0.2162 mg/ml=800.6213 U/mge3= b3/d3=112.414 U/ml0.0748 mg/ml=1503.7058 U/mg以除去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）得到的SOD纯化倍数为n1=1，以各样的比活力计算纯化倍数，样2和样3的纯化倍数分别为：n2= e2/ e1=800.6213 Umg-1/161.2048 Umg-1=4.96n3= e3/ e1=1503.7058 Umg-1/161.2048 Umg-1=9.32酶活力测定的结果汇总于下表：提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性U/ml总活性U比活性U/mg回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清101.8903304.8733048.276161.20481001热变性后上清9.50.2162173.1031644.483800.621353.954.96丙酮沉淀后的8.50.0748112.414955.5171503.70631.359.323. SOD同工酶鉴定同工酶电泳凝胶中出现两条透明酶带，模式图绘制如下两条透明的酶带说明猪血中含有SOD同工酶，同工酶将核黄素经光照后产生的活性氧O2-（氧自由基）清除，使得凝胶呈无色透明。四、 分析超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于真核细胞核和原核细胞的细胞质、线粒体和叶绿体中，可清除生物体内超氧阴离子自由基，有效抵抗氧自由基对机体的伤害1。通过对SOD的提取、分离和纯化，发现猪血中含有丰富的SOD，且SOD的活性较高。此外，通过对提取样液的聚丙烯酰胺凝胶，可以看出猪血中还含有SOD的同工酶。本实验中分离纯化的SOD在丙酮沉淀后的比活力为1503.7058 U/mg，与李敏康2等研究显示的猪血SOD比活力较为一致。但前人对猪血中SOD活力研究表明，在60下处理15 min，SOD活力最大，比活力可达4 000 U/mg以上3-4，更有研究表明猪血中SOD比活力可以达到6 000 U/mg以上5-6，影响猪血中SOD活性的因素很多，从猪血中提取SOD的过程中，若要分离出纯度很高的SOD，热变性时的温度是至关重要的因素3,7-8。实验结果显示猪血中SOD回收率仅为31.35%，纯化倍数仅有9.32。而前人在丙酮沉淀后SOD的回收率可以达到近60%甚至更高4,6，晏本菊4等从猪血中制备SOD时纯化倍数达26.00。SOD同工酶电泳结果表明，猪血中含有SOD的同工酶，且活性较高，但是种类数量很少。对于SOD 的同工酶，在水生生物（鱼类等）和植物中研究较多9-12，而关于猪血中SOD同工酶鲜见报道。对其他动物和植物的研究显示，SOD的同工酶种类较多，分子量分布也较为广泛9-12。本实验中提取的猪血中的SOD的比活力相对较低，回收率和纯化倍数也非常低，鉴定出的SOD同工酶数量极少，可能的原因有供试用猪血新鲜程度不够，导致其中S