李依 食品酶学 丝氨酸蛋白酶.doc

丝氨酸蛋白酶的研究【摘要】综述了丝氨酸蛋白酶的结构与功能、蛋白质工程、表达系统和应用。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中发挥着重要而又广泛的生理作用，具有广泛的研究和应用价值。它们的活性部位都含Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制。丝氨酸蛋白酶超家族成员执行多种多样的生理功能，在很多致病过程以及细胞内的信号转导等方面起着重要作用。正是由于丝氨酸蛋白酶在结构上的微小变化，从而引起了其在功能上的进化。On serine proteaseAbstract： This paper reviews the serine proteasesstructures，functions，protein engineering，expression system，and applicationsSerine protease is a group of proteolytic enzymes that are important for its potential applicationsAll serine proteases have serine，histidine and aspartic acid in their active domain，and same catalytic mechanismThe members in the serine protease super family serve a wide range of physiological functions，especially in thepathogenesis of many diseases and intracellular signal transductionAny minute alternations in their structures canresult in significant functional changes【关键词】 丝氨酸蛋白酶 抑制剂 表达 结构 【正文】一 丝氨酸蛋白酶的概述1 简介丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（其名字的由来）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。(1)消化酶 胰分泌的酶里面有三种是丝氨酸蛋白酶：A 糜蛋白酶糜蛋白酶，又称为胰凝乳蛋白酶，水解酶类的一种肽链内切酶，主要促使疏水性氨基酸尤其是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端多肽裂解。由胰以糜蛋白酶原的形式分泌，在小肠内经胰蛋白酶作用而激活。糜蛋白酶A及B分子大小不同，但特异性则相似。B 胰蛋白酶胰蛋白酶属水解酶类，促使肽链分裂，作用部位为精氨酸或赖氨酸羧基。此酶以酶原形式由胰释出，在小肠中转化为活性形式。C 弹性蛋白酶弹性蛋白酶（EC 3.4.21.36.）：水解酶类的一种，对丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸等含羧基的多肽键起催化水解的作用，因曾认为此酶主要作用于弹性蛋白而有此命名。它是胰以酶原(弹性蛋白酶原)形式分泌的一种丝氨酸蛋白酶，参与肠内蛋白消化。这三种酶的一级结构（氨基酸序列）和三级序列（所有原子的空间排布）相似。它们的活性丝氨酸残基都是在同一位置(Ser-195)。(2)凝血因子 几种激活的凝血因子都是丝氨酸蛋白酶，包括：A凝血第十因子（X），也称Stuart因子，参于内源性和外源性凝血途径的一种耐贮存因子。缺乏可致系统性凝血障碍（第十因子缺乏症）。B凝血第十一因子（XI），即是血浆凝血酶致活酶先质：作用于内源性凝血途径的一种稳定因子。缺乏这种因子会引起系统性血凝缺陷，即C型血友病或Rosenthal综合征，与典型血友病相似。凝血酶来自凝血酶原，可促使纤维蛋白质变为纤维蛋白的酶；C纤维蛋白溶酶，胞浆素，：是溶解纤维蛋白或血凝块系统的有效部分，是对纤维蛋白有高度特异性的蛋白分解酶，对已经形成的纤维蛋白凝块有特别的溶解力，对其他血浆蛋白、凝固因子和一般蛋白质也有类似作用。（3）补体系统 补体系统里面有几种蛋白质属于丝氨酸蛋白酶，包括：A C1r 和 C1sB C3转化酶裂解补体成分C3为C3a和C3b的酶；经典途径C3转化酶是C4b，2a；旁路C3转化酶是C3b，Bb和C3b，Bb（4）作用原理A 通过邻近的氨基酸残基链，丝氨酸残基在活性中心被激活。B 被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应。C 肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端会被释放游离。D 水解反应，与酶相连的碳端产物被释放。反应完成。 【1】 【2】2 作用丝氨酸蛋白酶存在于大多数的生物体内。迄今为止,基于不同的氨基酸序列、氨基酸三级结构以及催化残基的序列丝氨酸残基、组氨酸残基、天门冬氨酸残基组成了至少个不同的家族类型。丝氨酸蛋白酶主要包括肠激酶、凝血酶、纤溶酶、类胰蛋白酶、粒酶、胰酶、血浆激肚释放酶等。这类酶都具有丝氨酸残基,组氨酸残基,天门冬氨酸残基,在催化过程中,酶残基中的经基氧对肤链中的拨基碳进行亲核进攻,进而将肤链水解为段。近年来对这类酶已经有广泛研究,发现它们在一系列的生理过程如消化、凝血、胚胎发育以及免疫应答等中起重要作用。丝氨酸蛋白酶催化的串连水解过程是由一系列非活性的丝氨酸前蛋白和一个能引发相应应答的特异性刺激物组成,一旦串连水解被激活,不同的前蛋白就会逐步激活,导致迅速不可逆的特异性细胞应答,这些酶对维持机体的内环境稳定有重要作用,一旦它们处于不规则状态下,机体正常的生理条件就可能遭到破坏。【4】二 丝氨酸蛋白酶的抑制蛋白酶抑制剂（，）是一类具有抑制蛋白酶活性的物质，有机体内的内源性蛋白酶抑制剂一般是分子量相对较低的生物大分子，而小的非蛋白类抑制剂大多来源于微生物丝氨酸蛋白酶抑制剂作为主要的蛋白酶抑制剂之一，可以调控生物体内的多种生理反应、与蛋白酶的活性部位结合、抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用，在一系列的生理病理过程中也起着关键性的调控作用有关抑制剂对蛋白酶活性的抑制作用机理，目前主要通过的“标准机制”进行解释同时，的“排水沟阻塞机制”和的抑制剂分子刚柔性观点则从不同角度和层次进行了补充抑制剂及其与相应的蛋白酶形成的复合物的结构及生理功能之间的联系，将随着从结构生物学等方面研究的深入而逐步被阐明。（1）丝氨酸蛋白酶抑制剂的一级结构。对不同来源的蛋白酶抑制剂的一级结构研究表明，其分子一般由个氨基酸组成，个别可达个氨基酸，这些蛋白酶抑制剂大多属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族其中植物来源的型蛋白酶抑制剂的结构中都存在一种由个氨基酸形成的环状肽段，此结合环与蛋白酶的抑制活性有着密切的关系通过对型蛋白酶抑制剂的结合环的氨基酸序列进行分析，结果显示这类抑制剂处于活性区域内结合环上从。到。残基有着较为保守的氨基酸组成：即（其中代表决定抑制专一性的活性残基，代表种氨基酸中的任意一种。（2）典型丝氨酸蛋白酶抑制剂分子内的高级结构信息典型丝氨酸蛋白酶抑制剂均有一个具有特征性构象的暴露在分子外侧的结合环，这种结合环在所有抑制剂分子及酶一抑制剂复合物中都保持一致的构象构象预测及结晶学研究均显示结合环形状扁平，比较适合于贴近或进人蛋白酶活性部位的缝隙在该环上有一个活性位点肽键，使得这类抑制剂可以作为所有同源酶的底物有研究测量了大豆胰蛋白酶抑制剂（）与相应胰蛋白酶结合时的氢离子释放情况，通过对反应过程的观察，认为酶和抑制剂形成复合物后，抑制剂分子中的。一（一）氨基酸间肽键被专一性水解，整条肽链被切割成两个片段而在其他来源的该抑制剂与酶结合时，如：牛胰蛋白酶抑制剂（），位点是残基相应肽键发生水解，并且当残基被乙酰化后，其抑制胰蛋白酶的活性几乎全部丧失。（3）蛋白酶与抑制剂相互作用的机制由于蛋白酶抑制剂分子刚性较强，所以无论在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰肽酶还是枯草杆菌蛋白酶等相应的抑制剂中存在着一种分子间相互作用的“标准机制”，酶促反应动力学公式为：式中为酶，为抑制剂，为酶一抑制剂形成的中间产物，为被酶水解修饰后的抑制剂从三维空间结构匹配的角度来看，蛋白酶抑制剂可作为相应蛋白酶的合适底物，但从动力学常数间相互关系上来看，在中性值条件下，虽然反应的值很大，但和却比酶的正常底物浓度低几个数量级因此这类蛋白酶抑制剂对酶的抑制作用在于二者之间紧密的结合，形成不易解离的酶一抑制剂复合物研究也表明抑制剂活性部位肽键的水解和水解后的肽键在复合物形成时再合成的过程都遵循着这种标准机制。 【5】三 丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，参与凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、炎性介质反应及组织重建过程。1995年Sprecher等从人胎盘eDNA文库中首先筛选并分离出一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，命名为PI-9，属于人丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，卵清蛋白家族中的新成员。近些年来，对于P1-9的结构功能、表达分布及调节、抑制细胞凋亡机制、肿瘤及移植免疫耐受等方面的研究已取得一定进展。1 H-9的分子结构与功能特点人类PI-9基因定位于染色体6p25，由7个外显子和6个内含子组成，PI-9mRNA大小分别为34 kb和44 kb。P1-9编码一种含有374个氨基酸残基的单链蛋白，分子量约为42 kD，定位于细胞核和细胞浆。PI-9与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂相似，具有高度保守的三级结构，主要包括9个仅螺旋、3个B折叠和1个位于羧基末端的功能结构域，即功能活性反应中心(reactive center loop，RCL)，但其氨基末端缺乏一个可裂解的信号序列01-2。RCL位于距羧基端3040个残基区域，为一环状的结构域，RCL内的氨基酸残基序列和构成并非恒定不变，不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂其RCL氨基酸残基序列和构成不尽相同。RCL上存在一个能被靶酶所识别的位点，即PlP1位点，该位点的氨基酸残基构成将决定该蛋白酶抑制剂功能的特异性。例如，P1-9 RCL的P1位点为Glu340，是人丝氨酸蛋白酶抑制剂家族位于P1位点的唯一酸性氨基酸残基，其与GrB天然底物的结构相似。PI-9因P1位点为Glu可被GrB迅速识别，更为重要的是，PI-9 RCL中P4位点的谷氨酰胺(Glu344)是其与GrB紧密连接必不可少的结构，P4与GrB的Lys”形成牢固的盐桥结构，使PI-9与GrB形成高度稳定、难以解离的复合物而导致GrB失活旧J。另外，Mahms等H1研究发现PI-9能被存在CTL和NK中含量较少的颗粒酶M有效地降解，致PI-9功能失活，参与调节细胞凋亡。2 PI-9表达的作用PI-9是丝氨酸蛋白酶抑制剂中唯一具有抑制GrB介导的细胞凋亡和白细胞介素一lB转换酶(IL一1 Bconvening enzyme，ICE protease，Caspase1)介导的炎性介质反应的功能蛋白，故其在抗细胞凋亡与抗炎性介质反应过程中发挥重要作用。21抗细胞凋亡CLs清除体内感染细胞(病毒、细菌)及肿瘤细胞主要通过PFPGrB和FasFasL路径介导细胞凋亡，维持机体自稳。近来研究发现，PI-9在抗细胞凋亡中可能起到重要作用。GrB是丝氨酸蛋白酶家族中的重要成员，在颗粒酶B介导的靶细胞凋亡过程中起核心作用，能迅速引起靶细胞DNA断裂，最终导致细胞凋亡。PI-9是迄今为止发现的唯一具有抑制GrB活性功能的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白能阻断GrB所致的DNA降解，从而具有抑制GrB诱导的细胞凋亡作用。Bird等孔通过对乳腺癌细胞株MCF-7的研究发现，转染野生型PI-9的癌细胞可明显抵抗CLs的杀伤作用，而转染基因突变、无活性的PI-9的癌细胞则大量凋亡。此外他们研究证实，PI-9只通过PFPGrB抑制细胞凋亡，在FasFasL未起作用。最近研究发现，PI-9不仅能抑制PFPGrB路径介导的细胞凋亡，还能通过抑制FasFasL路径介导细胞凋亡，提示在抑制细胞凋亡中PIO可能发挥越来越重要的作用4|。22抗炎性介质反应Caspasel可激活促炎症细胞因子ILl B和IL一18前体，介导免疫和炎性介质反应。James等5。研究显示，PI-9是Caspasel的潜在抑制剂，其表达与Caspase1活性及IL1B产物呈负相关，即PI-9低表达时Caspasel的活性增强，ILl B产物增多，促进免疫和炎性介质反应，反之亦然。这提示PIO在活体内抑制炎性介质反应和免疫反应中具有重要的调节功能。 【3】 【8】四 丝氨酸蛋白酶的重组表达丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物、植物、细菌、病毒、真菌中，并且参与生命的各种反应 蛋白质翻译后后加工、细胞分裂、病原体感染、组织降解、细胞凋亡等。可见丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值。该类酶因其活性中心具有一个独特易反应的丝氨酸残基而得名，此残基与有机磷如二异丙基氟磷酸有不可逆反应。近来已经有愈来愈多的丝氨酸蛋白酶在组织或微生物体内被发现，但是它们表达水平极低并且只在生命的特定阶段表达。因此，采用生化提取方法分离很难获得足够量的蛋白。目前，基因克隆与表达的技术日益成熟，在酶学研究中很快取代了生化提取方法。并且，通过重组技术直接获得蛋白酶的结构变化已经广泛用于丝氨酸蛋白酶的机理和功能研究。目前，用于重组蛋白质表达的表达系统种类繁多，根据表达宿主种类的不同可将之分为四类：细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统。丝氨酸蛋白酶已经在这些系统中获得成功表达。虽然在各种表达系统中都有丝氨酸蛋白酶成功表达的先例，但是新的丝氨酸蛋白酶表达的结果仍然很难马上预测，所以有必要同时试用多种表达系统。一般说来，如果只是为了表达非活性蛋白酶用于制备抗体，细菌表达系统应为首选。如果原核表达系统不能表达出活性蛋白酶，同时又不需大量产物的话，最好转用真核表达系统。哺乳动物表达系统表达丝氨酸蛋白酶虽然很成功，但其费用昂贵。该系统一般适于必需类似哺乳动物翻译后修饰的蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的立体结构是高度保守的，但由于蛋白多肽的表达后加工和修饰不同，其后加工对酶的功能、结构、理化特性产生的影响大小不一，所以现在还没有一个表达系统被证明是适于所有丝氨酸蛋白酶的异源表达的，所以选用之前一定要慎重考虑不同系统的优缺点和研究目的。选择一个最符合表达要求的载体是很明智的，但是如果初次失败了也不要轻易放弃。另外，研究者还需要考虑目的蛋白酶本身的特性，如是否需要辅因子辅助活性的发挥 或是金属离子的稳定作用等。从大量文献可以发现，大多丝氨酸蛋白酶在异源表达系统表达时，多表达为酶原形式。这可能是因为1蛋白酶活性形式对宿主有毒性。有报道表明：对于同一种酶，在相同表达系统中，无活性形式的蛋白酶较活性形式的蛋白酶表达水平高TM 2Istv6n认为糜蛋白酶原的propeptide对其成熟蛋白的折叠和功能发挥有一定影响。 “3有文献报道丝氨酸蛋白酶，如糜蛋白酶有自我裂解的特性 。由此看来，欲获得丝氨酸蛋白酶的成功表达需要综合考虑载体、宿主细胞、目的蛋白酶的特性及研究目的等多方面的因素采用不同的表达系统进行表达。 【10】五 丝氨酸蛋白酶线粒体细胞肿瘤发生中的作用丝氨酸蛋白酶在各种细胞中有着广泛的作用，包括凝血、创伤愈合、消化、免疫反应、肿瘤侵袭和转移。定位于线粒体中的丝氨酸蛋白酶和有着重要的生理功能，其异常表达在肿瘤发生过程中起重要作用。1蛋白酶的管家和调节功能蛋白酶对维持细胞的呼吸功能和内环境稳定极其重要。类蛋白酶家族成员极其保守，与类的蛋白酶特异性相关的差异性序列定位于氨基端的第个蛋白结构域与两个催化位点之间。蛋白酶是存在于酵母菌的线粒体基质的类蛋白酶，其纯化酶以同源七聚体构成了约的复合物，两个复合物进一步组装成天然酶。在整个生物界内依赖性蛋白酶高度保守，因此基于对酵母菌的研究，可以预测出在高等真核细胞线粒体内的相关同源酶的重要功能。1.1 参与线粒体代谢直接参与线粒体（，）的代谢，而且其与和结合要受核苷酸抑制和蛋白质促进的调节。人蛋白酶以单链形式按照位点和链特异的方式结合单链的富含碱基区域，并且与轻链的启动子相重叠。免疫共沉淀实验表明，和的多聚酶伽玛和双螺旋链相互作用。能抑制结合和，而蛋白质代谢物能提高和的亲和力约倍。核苷酸抑制作用和蛋白质促进作用协同调节和的结合，该过程是通过全酶的构象改变实现的。研究表明，蛋白酶位的起催化作用的保守丝氨酸残基突变为丙氨酸时，该酶将完全失去蛋白溶解活性，其相应细胞则不能维护线粒体基因组的完整性；相似情况也见于蛋白酶的结合结构域的位保守赖氨酸残基突变为天冬酰胺时。可见，类蛋白酶可能通过结合并降解与启动子临近位点的调节蛋白的方式来调节的复制和（或）转录。1.2 维持前体稳定性酵母菌线粒体的基因表达涉及到几个前体的加工。许多基因缺乏自己的启动子因而被转录为大的转录单位的一部分，例如细胞色素氧化酶、合成酶亚单位和亚单位的基因都被转录为一个多顺反子前体，最初的转录体须经过加工才能产生信使（）和转运（）。在含有野生型且蛋白酶突变的菌株，虽然细胞色素氧化酶和细胞色素基因可以正常转录，但 分析却检测不到前体或成熟形式的细胞色素氧化酶和细胞色素的。蛋白酶在细胞色素氧化酶和细胞色素的代谢中的作用与这些基因中含有多个内含子有关（细胞色素氧化酶有个内含子，细胞色素有个内含子），因为在蛋白酶突变且不含有线粒体内含子的菌株中，细胞色素氧化酶和细胞色素的可达到正常水平。1.3 参与内含子剪切为了明确证实蛋白酶在剪切中的作用，研究者构建了一个蛋白酶突变的菌株，该菌株含有野生型和仅含有个内含子、的短细胞色素基因。内含子不编码成熟酶，无论蛋白酶存在与否都可被剪切。内含子编码成熟酶，借助细胞色素外显子特异的探针进行分析表明，与野生型细胞相比，蛋白酶突变的菌株积累了大量的含有内含子的稳定的细胞色素前体，而仅有少量的成熟细胞色素的。这些结果表明，至少有一个编码成熟酶的内含子在进行有效剪切过程中需要蛋白酶。2.蛋白酶的调节凋亡功能年个研究机构几乎同时鉴别出是定位于线粒体的具有凋亡调节功能的蛋白酶蛋白可经由两条途径而起促凋亡作用：结合凋亡抑制子（ ，）通过天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（）依赖的方式促凋亡；凭借其丝氨酸蛋白酶活性以非依赖的方式促凋亡。凋亡即程序性细胞死亡，可由外在的或内在的信号启动，激活内源性蛋白酶如，引发细胞降解。凋亡的生理性调控包括、一、促凋亡因子关蛋白等。基因家族高度保守，存在于从昆虫到哺乳动物的多种生物。可直接结合并抑制，同时参与细胞周期调节和调控受体介导的信号转导。2.1干扰和的相互作用可以结合并抑制从而在凋亡调节过程中发挥关键作用。通过剪刀样的基序与一染色体连锁（，）结合，研究中发现丝氨酸蛋白酶是第个具有剪刀样基序并与哺乳动物结合的蛋白酶。该蛋白酶通过自我加工形成具有与剪刀家族蛋白质相似的氨基端序列。线粒体中有全长序列的，也含有加工成熟的，但不能与发生相互作用，只有伴随着凋亡的发生时，它们才转移到细胞质中并与发生相互作用。等用杆状病毒凋亡蛋白抑制子第重复序列作为亲和试剂，通过杆状病毒凋亡蛋白抑制子第重复序列结合肽的洗提、微序列分析和光谱测定法证实，线粒体中成熟的丝氨酸蛋白酶能直接结合杆状病毒凋亡蛋白抑制子第重复序列的蛋白质和激活子。过表达使细胞对凋亡敏感化，而用干扰抑制表达可减少细胞凋亡。2.2协同丝氨酸蛋白酶活性和拮抗能力等发现哺乳动物细胞中的同源类似物是，能够结合和杆状病毒来调节凋亡。在健康细胞中大部分存在于线粒体内，当接受紫外线照射时，转移至细胞质中，并与发生作用。在体外，能够阻止对活性的抑制，并且在紫外线诱导哺乳动物细胞凋亡时能对抗对细胞的保护作用。研究表明，成熟氨基端在与发生相互作用时起重要作用的丙氨酸或者具有蛋白酶活性的丝氨酸残基，两者任意一个发生突变都将减弱促进凋亡的能力；而在二者都突变时，促进凋亡活性将全部缺失。由此可见，丝氨酸蛋白酶的活性和拮抗的能力在促进细胞凋亡过程中是相互协同的。 【6】六 丝氨酸蛋白酶的蛋白质工程蛋自质工程就它的涵义来说, 就是把天然蛋白质分子的一部分加以变更或改造, 甚或从头设计、创造自然界中不存在的全新蛋白质分子, 使之适合于功能上某一特定的目的。从技术上说, 蛋白质工程应用基因工程的D N A 重组技术, 把克隆了的基因的D N A 编码序列加以改变, 或者人工合成新的基因, 再把改造过的基因或人工合成基因通过载体在合适的宿主系统中加以表达, 从而产生数量几乎不受限制、性能上具有特定功能的突变型蛋白质分子或全新的蛋白质分子。丝氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶。胰脏分泌的消化酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶, 血液凝固中的凝血酶都属于丝氨酸蛋自酶家族。它们的氨基酸序列表