现代分子生物学第二章.ppt

Chapter2StructureandfunctionofNucleicAcids Contents2 1细胞的遗传物质2 2核酸的化学组成与共价结构2 3DNA的二级结构2 4DNA的超螺旋结构2 5真核生物的染色体及其组装2 6RNA的结构和功能2 7核酸的性质2 8研究核酸的常用方法 第一节细胞的遗传物质 一 DNA是主要的遗传物质1 In1869 Miescher 分离出核素2 In1930s P LeveneandW JacobsRNA 核糖 碱基DNA 脱氧核糖 碱基 3 In1928 FrederickGriffith 细菌的转化实验 光滑型 S 肺炎双球菌可致小鼠死亡 粗糙型 R 肺炎双球菌不会导致小鼠死亡 加热杀死S型 小鼠不会死亡 将R型和加热杀死的S型混合后注射小鼠 小鼠死亡 结果分析 R型在转化过程中从杀死的S型获得了基因 遗传物质 4 DNA是转化物质In1944 OswaldAvery 1 将S型杀死后分别提取多糖 脂类 RNA 蛋白质 DNA等分别加入R菌中 仅加入DNA的发生了转化 2 向提取液加入胰蛋白酶或糜蛋白酶 转化可发生 3 向提取液加入DNA酶 转化不能发生 4 直接的理化分析超速离心 Ultracentrifugation 转化的物质沉降的速度快电泳 Electrophoresis 转化物质移动的速度快紫外吸收转化物质在260nm波长处有最大吸收峰基本化学分析 N P比为1 67结论 DNA是转化物质 1950年 ChargaffDNA并不是四核苷酸的简单重复 DNA碱基组成在不同物种之间不同 Hotchkiss将转化物质纯化到只含0 02 的蛋白质 转化仍可发生 5 噬菌体侵染实验 1952年 HersheyandChase 二 RNA也是遗传物质In1957 HeinzFraenkel ConratandB Singer 烟草花叶病毒重建实验 小结 基因由核酸组成 通常是DNA 一些简单的遗传系统 如病毒 是RNA 作为遗传物质的DNA具有以下特性 贮存并表达遗传信息能把遗传信息传递给子代物理和化学性质稳定有遗传变异的能力 第二节核酸的化学组成与共价结构 一 核酸的化学组成核酸 Nuleicacid 核苷酸 Nucleotides 核苷 nucleosides 磷酸 Phosphoricacid 戊糖 pentose 碱基 Bases 一 碱基 Bases 嘧啶碱和嘌呤碱 二 核苷 Nucleosides 糖与碱基之间以糖苷键相连核糖核苷脱氧核糖核苷 三 核苷酸 Nucleotides 二 核酸的共价结构 一 DNA的一级结构DNA分子中的核苷酸序列3 5 磷酸二酯键5 末端 自由的磷酸基团3 末端 自由的羟基 二 RNA的一级结构无分支的多聚核糖核苷酸链4种核糖核苷酸 A G U C核苷酸中的戊糖为核糖 第三节DNA的二级结构 一 DNA双螺旋模型的诞生In1951 Pauling 螺旋Chargaff A T G CIn1952 FranklinandWilkins 清晰的X 射线衍射照片In1953 WatsonandCrickDNAdoublehelixmodel 二 双螺旋模型的特征1 主链 1 DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成 2 两条主链围绕同一中心轴相互缠绕 形成双螺旋 螺旋方向为右手螺旋 3 糖 磷酸主链位于双螺旋的外侧 碱基位于双螺旋的内侧 4 碱基对平面与螺旋轴垂直 2 碱基配对 3 螺旋参数 1 每一圈螺旋含10个碱基对 2 双螺旋螺距为3 4nm 上下相邻碱基的垂直距离为0 34nm 交角为36 3 螺旋直径为2nm 4 大沟和小沟大沟 宽1 2nm 深0 85nm 小沟 宽0 6nm 深0 75nm 三 维持DNA双螺旋的作用力1 氢键 Hydrogenbonding 2 碱基堆积力 堆积碱基间的疏水作用3 其他作用因素 1 范德华力 2 磷酸基的负电荷斥力 四 DNA双螺旋的多种形式B DNA Watson Crick模型A DNA 在较低的湿度下形成 RNA RNA RNA DNA杂交分子具有A DNA这种结构 A DNA B DNA Topview Topview Z DNA 左手螺旋的双螺旋DNA 其糖 磷酸骨架呈Z字形 Z DNA B DNA 小结 B DNA是最常见的DNA构象 Watson Crick双螺旋DNA A DNA构象对基因转录有重要意义 Z DNA可能与基因转录调控有关 左手螺旋 五 十字形结构由反向重复 回文序列 DNA形成 较长的回文结构 单链 可形成茎环结构 发夹结构 较长的回文结构 可形成十字形结构 六 三股螺旋DNA TriplehelixDNA 1 类型 分子内的DNA三螺旋结构 H DNA 分子间的三螺旋结构平行的三螺旋结构 2 氢键原来的双螺旋 Watson Crick氢键第三股链与双螺旋之一 Hoogsteen氢键 Watson Crick配对Hoogsteen氢键 3 意义 可能与基因表达调控有关形成三股螺旋结构可阻止调控蛋白的结合 从而关闭基因的表达 七 四链DNA端粒DNA G四链体结构 一 超螺旋DNA SuperhelixDNA 1 定义 DNA双螺旋自身盘绕而形成的空间结构 第四节DNA的超螺旋结构 2 功能 1 超螺旋DNA具有更为致密的结构 可以将很长的DNA分子压缩到染色体中 2 对DNA的稳定性具有十分重要的意义 3 正超螺旋和负超螺旋负超螺旋 negativesupercoil 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 2 正超螺旋 positivesupercoil 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋正超螺旋 4 超螺旋的定量描述White方程 L T W 1 连结数 linkingnumber L DNA闭环前两条链交叉的次数 2 扭转数 twistingnumber T DNA分子中的Watson Crick螺旋数目 3 超螺旋数 缠绕数 writhingnumber W 双螺旋DNA自身盘绕的次数 负超螺旋正超螺旋双螺旋DNA松开导致负超螺旋 而拧紧则导致正超螺旋 天然DNA分子一般为负超螺旋 Why 负超螺旋DNA更易于局部解链 易于参加DNA的复制 转录等 4 比连接差 表示DNA的超螺旋程度 L L0 L0大多数生物的超螺旋程度大约在 0 05左右 二 拓扑异构体 Topoisomers 具有不同连接数的相同DNA分子 Bp 360 L 36 T 36 W 0 Bp 360L 32 T 36 W 4 Topoisomerase 三 拓扑异构酶 Topoisomerase 能够改变DNA连接数从而改变DNA分子超螺旋水平的酶1 I型拓扑异构酶 作用机制 切开环状一条链 连接数改变 1 不需ATP2 型拓扑异构酶 作用机制 切开环状两条链 连接数改变 2 需要ATP TopoisomeraseII 3 细菌的拓扑异构酶 1 旋转酶 Gyrase topoisomeraseII 引入负超螺旋 与复制有关 2 拓扑异构酶I 松弛负超螺旋 与转录有关 第五节真核生物的染色体及其组装 一 染色体和染色质1 染色质 chromatin 指间期细胞核内由DNA 组蛋白 非组蛋白组成的线性复合结构 是间期细胞遗传物质存在的形式 2 染色体 chromosome 指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中 由染色质聚缩而成的棒状结构 3 二者关系 1 染色质与染色体具有基本相同的化学组成 但包装程度不同 构象不同 2 染色质与染色体是在细胞周期不同的功能阶段可以相互转变的的形态结构 4 形成染色体或染色质的意义压缩DNA提高稳定性有助于细胞分裂有助于重组 二 真核生物的染色质1 Euchromatin 常染色质 间期细胞核中 螺旋化程度小 分散度大 浅染的染色质特点 转录活跃2 Heterochromatin 异染色质 间期高度压缩 螺旋化程度高 深染的染色质特点 A 高度浓缩B 转录不活跃C 在细胞周期中表现为晚复制 晚S期 早凝缩 1 组成性异染色质 结构性异染色质 在整个细胞周期内都处于凝聚状态的染色质 主要为卫星DNA 构成染色体特殊区域 如着丝粒 2 功能性异染色质 兼性异染色质 指在某些特定的细胞中 或在一定的发育时期和生理条件下凝聚 由常染色质转变而来的异染色质如X染色体 巴氏小体是真核生物基因表达调控的一种途径 三 染色体的结构 chromosomestructure 1 有丝分裂期的染色体 2 Centromere 着丝粒 指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位 是纺锤体附着位点 1 功能 保证有丝分裂和减数分裂中复制的染色体平均分配到两个子细胞 2 着丝粒DNA 特点 含大量串联的重复序列 卫星DNA酵母着丝粒DNA 为单一序列 200bp 88bp富含AT序列 两侧保守区哺乳动物着丝粒DNA 长序列 大量的重复序列 3 Telomere 端粒 是真核生物染色体末端的起保护作用的一种特殊结构 1 功能 保持染色体的稳定性 2 端粒DNA 特点 A 短串联重复序列B 富含GCC 形成特殊的二级结构 四 真核生物染色体和染色质的组成 一 化学组成 DNA protein 蛋白质 Non histone非组蛋白Histone组蛋白H2A H2B H3 H4 H1 protein 二 组蛋白 Histones 核心组蛋白 H2A H2B H3和H41 种类非核心组蛋白 H1 2 组蛋白的特点 1 分子量小 核心组蛋白 10 20kDa H1 约23kDa 2 高度保守 3 核心组蛋白都有一个保守的组蛋白折叠结构域 4 碱性蛋白 20 30 Lys Arg 带正电荷 5 组蛋白肽链上氨基酸的分布具有不对称性组蛋白N端尾巴 6 核心组蛋白的可进行组蛋白修饰组蛋白乙酰化组蛋白甲基化组蛋白磷酸化 五 染色体的组装 一 核小体 Nucleosome 1 定义 由200bp的DNA和组蛋白组成的染色体的基本结构单位 2 核小体的组装核小体核心 Nucleosomecore组蛋白八聚体核心 octamericcorehistone H2A H2B H3 H4 2 146bpDNA 1 8turn left handed Topview Sideview Nucleosomecore146bp 1 8turn 染色体小体Chromatosome166bp 2turn DNA Histoneoctamer HistoneH1 H1 20bpDNA stabilize 连接DNA LinkerDNA 0 100bp 55bp LinkerDNA 核小体 Nucleosome 核小体的形成 DNA 146bp Histoneoctamer 组蛋白八聚体 Nucleosomecore 核小体核心 H1 20bpDNA Chromatosome 染色体小体166bp linkerDNA Nucleosome 核小体 200bpofDNA 二 10nm纤丝 Beadsonastring structure 三 螺线管 30nm纤丝 螺线管 Solenoid 直径30nmleft handed6个核小体 turn 微带 miniband 是染色质高级结构的单位 四 微带 miniband 螺线管结合到核骨架 染色体骨架上形成微带 第六节RNA的结构和功能 一 一级结构 primarystructure 与DNA区别 核糖 尿嘧啶 通常是单链 二 二级结构 Secondarystructure 部分序列自身回折形成局部双螺旋 tRNA rRNA G U碱基配对 hairpin bulge loop 假结 Pseudoknots 四环 Tetraloop 端环能够形成稳定的 保守的发夹结构广泛分布于体内rRNA 催化RNA和非编码RNA中 三 三级结构 tertiarystructure Thecrystalstructureofa23SrRNA tRNA 三碱基对 四 RNA的功能 1 储存遗传信息 如RNA病毒 2 mRNA 进行遗传信息的传递 作为蛋白质合成的模板 3 rRNA 可装配成核糖体 参与蛋白质合成 4 tRNA 携带氨基酸 参与蛋白质的合成 5 核酶 内含子的自我剪接等 6 MicroRNA 基因表达的调控 在发育过程中起作用 7 SiRNA 抑制病毒 转座子等外源基因的表达 8 指导RNA 参与RNA的编辑 9 SnoRNA 可能与RNA的甲基化有关 10 SnRNA 参与RNA的加工 如剪接 第七节核酸的性质 酸碱性质浮力密度紫外吸收变性和复性 一 酸碱性质 1 DNA等电点4 4 5 2 RNA等电点2 2 5 3 带负电荷 4 应用 琼脂糖凝胶电泳电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由负极向正极移动 二 浮力密度 buoyantdensity 应用 1 密度梯度离心 DNA的纯化8MCsCl RNA DNA protein 2 确定DNA平均GC含量 1 66 0 09 G C 蛋白质 染色体 线形DNA 超螺旋质粒 RNA CsCl EB 三 紫外吸收 DNA RNA max 260nmprotein max 280nmA260 nucleotides ssDNA RNA dsDNA 应用 1 核酸的定量1mg ml A260 20 dsDNA 1mg ml A260 25 ssDNA RNA 2 DNA纯度的鉴定A260 A280 1 8 puredsDNAA260 A280 2 0 pureRNAA260 A280 1 0 pureprotein 3 监控DNA的变性和复性过程DNA的变性 紫外吸收增大 增色效应 DNA的复性 紫外吸收减小 减色效应 四 核酸的变性和复性 一 变性 Denaturation 核酸双螺旋区的氢键断裂 变成单链 不涉及共价键断裂 1 碱处理 alkali DNA 酮 keto 烯醇式 enolate 变性2 化学试剂尿素 Urea 甲酰胺 formamide 等 高PH 应用 1 Southern印迹中 在转膜前通常将凝胶中的DNA进行碱变性 2 测序胶 变性PAGE凝胶 尿素 3 Northern印迹中 上样前通常用甲醛使RNA变性 3 热变性 Thermaldenaturation 1 熔解温度 Tm DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度 2 影响DNA的Tm值的因素 DNA均一性均一性高 变性的温度范围越窄 据此可分析DNA的均一性 测定Tm 可推知G C含量G C Tm 69 3 2 44 Tm与 G C 含量的关系 G C含量与Tm值成正相关 介质中离子强度离子强度高 Tm高 二 复性 Renaturation 变性DNA在适当 一般低于Tm20 25 条件下 两条链重新缔合成双螺旋结构 退火 Annealing 1 影响复性的因素 1 温度 热变性DNA在缓慢冷却时可以复性 快速冷却不能复性 2 DNA片段长度 DNA片段越大 复性越慢 3 DNA浓度 DNA浓度越大 复性越快 2 应用 PCR 引物与模板DNA的结合Southern和Northern杂交 DNA芯片 第八节研究核酸的常用方法 一 核酸的分离纯化1 DNA分离纯化真核DNA以核蛋白 DNP 形式存在 DNP溶于水或高盐溶液 1mol LNaCl 但不溶于低盐溶液 0 14mol LNaCl 据此 采用高盐提取 低盐沉淀 可将DNP与RNA核蛋白分开 提取出DNP DNP可用苯酚抽提 还可用氯仿 异戊醇去除蛋白质 水相中的DNA可被0 3MNaAC 乙醇沉淀 2 RNA的制备 1 RNase的灭活 玻璃器皿 高温焙烤塑料器皿 0 1 DEPC 37 过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加特异的RNase抑制剂 2 常用方法 异硫氰酸胍 苯酚 氯仿法异硫氰酸胍 氯化铯密度梯度离心法蛋白质 1 33g ml DNA 1 71g ml左右 RNA 1 89g ml mRNA的制备 oligo dT 纤维素亲合层析法 3 质粒DNA的提取碱裂解法 alkalinelysis 原理 根据环状质粒DNA与染色体DNA的拓扑学差异pH值 12 0 12 5 染色体DNA变性双链解开 质粒DNA的双链仍紧密结合pH值 中性 加入pH4 8的乙酸钾 质粒DNA准确复性 染色体DNA缠绕成网状结构 通过离心与RNA 变性蛋白质一起沉淀 被除去 菌细胞 1 悬浮细胞2 溶菌酶处理3 SDS NaOH4 醋酸钾中和 培养液离心 接种 过夜培养 3 5mL 水相 RnaseA二倍体积乙醇 CsCl EB 二 核酸的超速离心1 测定核酸的浮力密度2 测定DNA中GC的含量G C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系3 溶液中核酸构象的研究4 用于核酸的制备 三 核酸的凝胶电泳1 琼脂糖凝胶电泳 1 原理 电荷效应和分子筛效应 2 DNA移动方向 负极到正极 3 影响迁移率的因素 核酸分子的大小 凝胶浓度 DNA的构象 超螺旋 线形 带缺刻的环形 电压 不大于5V cm 4 染色 溴化乙锭 EB 0 5ug ml EB与DN