2020高中生物专题2微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案新人教版.docx

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数学习目标1.明确培养基对微生物进行选择的原理。2.学会统计微生物数量的方法。3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。知识点一筛选微生物的研究思路知识梳理1.菌株筛选(1)自然界中目的菌株的筛选筛选的依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。实例：从热泉中筛选出Taq细菌。热泉7080 的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq_细菌脱颖而出。(2)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。方法：利用选择培养基筛选。(3)选择培养基概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。制备方法：a在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。b改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物；尿素作为唯一氮源时，可以分离出能分解尿素的微生物。c改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。(4)分离分解尿素的细菌的培养基培养基组成提供的营养或作用KH2PO4 1.4 g无机盐Na2HPO4 2.1 gMgSO47H2O 0.2 g葡萄糖10.0 g碳源尿素1.0 g氮源、碳源琼脂15.0 g凝固剂用蒸馏水定容至1000 mL水从物理性质看此培养基属于固体培养基，是由于加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基，此培养基的氮源只有尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解并利用尿素；缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，受到抑制，所以，用该培养基能够筛选出分解尿素的微生物。2统计菌落数目(1)活菌统计法：稀释涂布平板法。原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。活菌数计算方法：每克样品中的菌株数(CV)M。C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：代表稀释倍数。统计方法：为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取其平均值。统计菌落数往往比活菌实际数目低的原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(2)总菌计数法：显微镜直接计数法。此方法需用特定的血细胞计数板进行计数，此方法不能区分细菌的死活。3设置对照(1)对照实验：除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验。(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如设置空白培养基作为对照组，观察培养基是否有杂菌污染。1.能在选择培养基上生长的一定是目的菌吗？提示：不一定。原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。2教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？提示：方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的。典题分析题型一选择培养基的选择作用例1在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C固氮细菌、霉菌、放线菌D固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌解题分析固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。答案C题后归纳选择培养微生物的两种方法(1)可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。(2)可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可大量增殖，在数量上占优势。题型二统计菌落数目的方法剖析例2自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将他们分离提纯，然后进行数量测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。对大肠杆菌进行计数，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。结果分析：(1)测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是_。A一个平板，统计的菌落数是230B两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。(3)用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量_，因为_。(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定大肠杆菌的品系被污染了？为什么？_。解题分析若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)为保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，取其平均值。(2)2120.21061.06109(个)。(3)因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起繁殖而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。(4)杂菌的出现可能是由于培养基灭菌不彻底或在培养过程中感染了杂菌。答案步骤：稀释涂布平板(1)D(2)1.06109个(3)多当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落(4)不能。因为不能确定杂菌的来源题后归纳两种统计菌落数目方法的比较项目显微镜直接计数法稀释涂布平板法(间接计数法)原理利用特定的血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、血细胞计数板培养基计数依据菌体本身培养基上的菌落优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低(当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落)计算公式每毫升原液含菌数40010000每小格平均菌体数稀释倍数每毫升原液含菌数某一稀释度下培养基上平均菌落数涂布平板时所用稀释液的体积稀释倍数注：表中400、10000都是常数。题型三对照实验的设置例3为了判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是()A未接种的选择培养基B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D接种了的选择培养基解题分析判断选择培养基是否发挥作用，自变量即选择培养基，因此对照实验应设置非选择性培养基，其他条件保持一致，故C正确。答案C技法提升微生物分离、计数时常见的对照实验有两种：第一种，判断培养基是否被杂菌污染，需同时将未接种的培养基进行培养；第二种，判断选择培养基是否有筛选作用，需同时设置牛肉膏蛋白胨培养基，并对其接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，通过对比得出结论。知识点二实验设计及操作知识梳理1.实验设计及操作提示步骤实验操作操作提示土壤取样土壤微生物约70%90%为细菌，主要分布在距地表38 cm土壤层。要求：从富含有机质、酸碱度接近中性土壤中取样；取样层：先铲除表层土，在距地表约38_cm的土壤层取样；将样品装入事先准备好的信封中取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和尿素为唯一氮源的选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用续表步骤实验操作操作提示样品的稀释和涂布称取10 g土样加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL无菌水的无菌大试管中，按照上述流程进行样品的稀释；按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管应在火焰旁称取土样。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞；由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103107倍的稀释液；实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等；稀释倍数：a.测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养。b.测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释。c.测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释培养观察将平板倒置于3037 温度下培养12 d，每隔24 h统计一次菌落数目不同微生物往往需要不同的培养温度和时间一般来说，在一定的培养条件下，同一种微生物表现出稳定的菌落特征，包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面计数选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目2结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他氮源选择培养基的筛选作用牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近3菌种鉴定(1)原理：CO(NH2)2H2OCO22NH3，分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强，pH升高。(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。1.不同的微生物培养的温度和时间相同吗？提示：不相同。细菌一般在3037 温度下培养12 d；放线菌一般在2528 温度下培养57 d；霉菌一般在2528 温度下培养34 d。2为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/g)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。3菌落计数时，除了采用稀释涂布平板法和显微镜直接计数法外，还可以采用什么方法？举例说明。提示：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例：将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。典题分析题型四分解尿素的细菌的分离与鉴定例4如表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素蒸馏水1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g定容至1000 mL(1)该培养基只允许分解尿素的细菌生长，这种培养基称为_培养基。该培养基会抑制其他种类微生物生长，其原因是该培养基_。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(3)若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，上述培养基中还需要添加的成分是_，接种时应采用_法。(4)从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入_指示剂，培养该菌后，如果指示剂变_，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)某同学用0.1 mL稀释液在稀释倍数为106的平板中测得菌落数的平均值为163，则每毫升样品中的细菌数是_。解题分析(1)该培养基以尿素为唯一氮源，只允许分解尿素的细菌生长，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长，这种培养基叫作选择性培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型生物，所以在培养过程中需振荡。(3)若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，需用固体培养基，故上述培养基中还需要添加的成分是琼脂，接种时应采用稀释涂布平板法。(4)由于细菌分解尿素的过程中产生了氨，氨使培养基的pH升高，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入酚红指示剂，培养该菌后，如果指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)某同学用0.1 mL稀释液在稀释倍数为106的平板中测得菌落数的平均值为163，则每毫升样品中的细菌数为1630.11061.63109(个)。答案(1)选择以尿素为唯一的氮源，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长(2)尿素葡萄糖为“目的菌”提供氧气(3)琼脂稀释涂布平板(4)酚红红(5)1.63109个技法提升微生物的筛选与鉴别方法(1)微生物的筛选方法单菌落挑取法利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物选择培养法利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物鉴定培养法利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物(2)微生物的鉴别方法菌落特征鉴别法根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别指示剂鉴别法如在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素染色鉴别法如在培养基中加入伊红美蓝，根据培养基中是否出黑色菌落来筛选大肠杆菌课堂小结当堂检测查漏补缺巩固提升1土壤中分解尿素的微生物所需氮源为()A硝酸 B氨 C尿素 D蛋白胨答案C解析只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源使其生长、发育及繁殖受到抑制，所以，以尿素为唯一氮源的培养基能够选择出分解尿素的微生物。2某同学对101、102、103倍稀释液中的细菌进行计数，平均菌落数分别是2760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)()A2.76104个/mLB2.95105个/mLC4.6104个/mLD3.775104个/mL答案B解析某同学在101、102、103倍稀释的平均菌落数为2760、295和16，为保证结果准确，一般选择菌落在30300的平板进行计数，因此只有295符合要求，其稀释倍数为102，所用稀释液体积为0.1 mL，代入计算公式2950.11022.95105个/mL。3用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是()A平板上的一个菌落就是一个细菌B菌落中的细菌数是固定的C此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同答案C解析用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，但偶尔也能来自两个或多个细菌，所以此方法统计的菌落数可能低于活菌的实际数目。4测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是()A细菌个体小，真菌个体大B细菌易稀释，真菌不易稀释C细菌在土壤中数量比真菌多D随机的，没有原因答案C解析土壤中活菌的数量一般高于真菌的数量，为控制平板上的菌落数在30300之间，需要选择不同的稀释倍数，故C正确。5某同学要分离土壤