英文文献 还原性纳米胶束 中文版.docx

题目：一种有潜力的抗肿瘤紫杉醇药物载体：基于含有二硫键的PEG共轭聚合物的聚离子复合物纳米胶束的制备一起还原敏感性摘要：这项工作的目的是开发一种用于传递抗肿瘤药物紫杉醇（PTX）的还原敏感型药物载体。N，N-二（丙烯酰）胱胺（CBA）与乙醇胺（AEOL）通过Michael加成反应生成含二硫键的阳离子聚CBA-AEOL（PCA）。接着，将聚己酸内酯（PLC）接枝于PCA上形成了一个新型还原敏感型聚合物即PCA-g-PLC接枝共聚物。PCA-g-PLC共聚物自组装成为平均粒径为108nm的球形胶束。观察模拟还原条件下逐步聚合发现：PCA-g-PLC共聚物中的二硫键使胶束具有还原敏感性。为了提高PCA-g-PLC在水溶液中的稳定性，具有羧基端的聚乙二醇甲基醚（mPEG-COOH）通过静电作用与PCA-g-PLC接枝聚合物共价连接形成具有亲水性PEG表面的聚离子复合物胶束。在体外，PTX从mPEG-PCA-g-PLC胶束的释放表现出还原敏感性，也就是：药物的释放速率与还原剂的浓度有很大的关系。在正常条件下，PTX的释放率低于30%，但在40mMolDTT的还原性条件下，药物几乎在9小时内完全释放。综上所述，具有还原控制释放性的mPEG-PCA-g-PLC胶束在提高紫杉醇的治疗效果方面有巨大的潜力。1、 前言目前，化疗一种是用于治疗癌症的常规方法。但是，传统应用于临床的抗癌化疗药物一般都是非特异性且毒性较高，因此会产生许多副作用包括恶心、神经病变、肾功能衰竭，这使得所用化疗药物的剂量搜到限制从而严重影响了化疗效率。抗肿瘤药物的水溶性、体内稳定性以及生物利用度等问题使得化疗方案也难以确定。自组装聚合物胶束作为化疗药物的传递系统很有前景，它可以增强药物的水溶性，控制药物的释放速率，降低药物毒副作用，延长药物在血液中的循环时间并且有特定靶向性。此外，已经有一系列胶束制剂类的抗癌药物进入了临床试验阶段。具有生物相容性的聚酯类已经广泛用作药物传递载体的材料，因为它们在体内经过几天到几周的时间内就可逐渐降解而不需要加入额外的物质来去除它们。聚酯类是用于自组装的聚合物的疏水部分，是在水溶液中进行的自组装胶束的核心而将会将疏水性药物包封于其中。FDA已批准可用于临床应用的常用的聚酯类有聚己酸内酯（PLC）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚丙交酯（PLGA）。为了避免复合抗药性，当载药胶束到达靶向肿瘤细胞之后需要将药物快速地释放。PH、温度刺激感应型胶束在特定PH、温度条件下能够很快的释放药物。与传统的PH、温度刺激感应型胶束药物载体相比，含有二硫键的生物可降解聚合物一类很有前景的载药材料。其在细胞内环境内通过巯基二硫化物交换反应在还原敏感性断裂上显示出独特的优势，且其降解速率比传统聚合物的酯水解速率更为迅速。研究发现，虽然在体内低谷胱甘肽（GSH）浓度（ca.2-20 uM）下二硫键是非常稳定的，但在高的谷光氨肽浓度（0.5-10mM）还原性条件下二硫键可以快速断裂（断裂时间范围由几分钟到几小时）。作为接枝、嵌段节点和交联剂作用的可还原聚合物中的二硫键常位于聚合物的主链以及支链上。二硫键在还原聚合物的位置以及分布会直接影响到自组装胶束的解组装、相应的药物释放行为。胶束的亲水性微环境也是一个影响二硫键断裂以及药物释放的重要因素。此次工作中中，我们合成了一种以具有生物相容性的聚己酸内酯为支链的主链含有较多二硫键的新型还原敏感型聚合物。随后，对还原敏感型聚合物的组装行为进行了研究，包括为了使得胶束在水溶液中更加稳定引入了可与还原敏感共聚物通过静电作用连接的亲水性共聚物（聚乙二醇）。同时，通过调整DTT浓度模拟体内不同的还原条件以考察合成聚合物的还原应答行为、聚合物组装形成的胶束、和典型抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)的还原-感应性释放行为。2、 试剂与方法2.1 试剂胱胺二盐酸盐、甲醇钠、平均分子量为1900的聚（乙二醇）甲基醚（Alfa Aesar公司）；DTT（产自Aladdin）；DMF、琥珀酸酐、AEOL(乙醇胺)（产自SinopharmChemical Reagent有限公司，DMF在使用前应用4A的分子筛干燥并进行再蒸馏）；MTT、-己内酯（-CL）(SigmaAldrich公司，-CL在使用之前要从氢化钙中进行减压蒸馏)。2.2N,N-二丙烯酰胺胱胺（CBA）的合成根据资料，CBA可有图.1所示的途径进行合成。将10mmol的半胱氨酸二盐酸盐溶于15mL3.5MNaoH与10ml氯仿的混合液中。将溶液加热至50，保持此温度在15分钟内不断搅拌的情况下，逐滴加入20mmol的丙烯酰氯。趁热进行相分离，弃去水相。余下有机相冷却至室温后沉淀即为产物。通过过滤、重结晶后的产物为白色晶体，产率为50%。2.3 具有羧基端的聚（乙二醇）甲基醚的合成具有羧基端的聚（乙二醇）甲基醚（mPEG-COOH ）可根据文献31中的方法制备。将平均分子量为1900的聚（乙二醇）甲基醚（mPEG-1900）（4.95g,2.5mmol）、甲苯置于烧瓶中在140下共沸干燥除去水分。相混合物中加入琥珀酸酐（10g,10mmol），于150搅拌反应5h。反应完成待混合物冷却后，加入二氯甲烷和乙醚进行沉淀。在使用CH2CL2/乙醚沉淀两次纯化产物mPEG-COOH。2.4 聚CBA-AEOL的合成聚CBA-AEOL（PCA）是由CBA与AEOL氨基通过Michael加成形成的聚合物。通常情况下，向以棕色反应烧瓶中加入CBA（2.60g,10mmol）、AEOL（0.61g,10mmol），用10ml体积比为10:1的甲醇/水溶液将其溶解。在45、N2环境、机械搅拌的条件下，并置于暗处反应10天进行聚合反应。接着，向体系中加入过量的AEOL以消耗未反应的丙烯酰胺，此反应持续两天。反应全部完成后，加入100mL水稀释，并且加入3M的HCL水溶液调节体系PH为3，用截留分子量为3500的分析膜进行聚合物的纯化。经冷冻干燥后，所得聚合物以盐酸盐的固体粉末形式保存。2.5 PCA-g-PLC共聚物的合成PCA-g-PLC共聚物是在不同进料比例的下单体/引发剂体系（如：不同的摩尔比的PCA、-CL）中由Sn（Oct）2催化发生的开环聚合反应合成而成。典型的聚合反应过程描述如下：向烧瓶中加入一定量的PCA和25ml的甲苯，通过在140蒸发15mL的甲苯进行共沸干燥除去水分。在经过旋转蒸发除去过量的甲苯后，向烧瓶内加入DMF、PCA，在室温下搅拌5min使其溶解。随后，向反应烧瓶内加入含有一定量Sn（Oct）2催化剂和-CL的DMF溶液，催化剂Sn（Oct）2的量一般固定取单体-CL的0.1mol%。对溶液氮气通气鼓泡30min进行脱气后，在110，液氮保护下回流24小时。液体冷却后，将其倒入100ml乙醚中进行沉淀（此过程反复两次）。用冷甲醇洗涤沉淀并在40下进行真空干燥，得到黄色粉末状的PCA-g-PCL。2.6 PCA-g-PCL胶束的制备利用透析的方法在水溶液中制备PCA-g-PCL胶束：将20.0mg的PCA-g-PCL共聚物粉末溶于2.0ml的THF中，轻微震荡1h。缓慢加入1.0ml蒸馏水，搅拌条件下反应2h，最后在室温下用截留分子量为3500的Spectra/Pro膜透析三天得到胶束粒子。用芘作为荧光探针确定PCA-g-PCL胶束的临界胶束浓度（CMC）。分别向小瓶中加入浓度范围为6.4 106-0.1 mg/mL的PCA-g-PCL共聚物，芘的浓度固定在6.0 107mol/L。将小瓶在室温下震荡24h后进行测定，用激发波长为390nm的F-4500荧光分光光度计（日立-4500）记录其荧光光谱。将在高、低浓度的I339/I337的强度比进行外推得到的交叉点认为是CMC。2.7 PCA-g-PCL胶束的还原敏感性在进行PCA-g-PCL胶束的还原敏感性研究之前，首先研究了PCA-g-PCL共聚物在10mMDTT的还原降解行为。固定DTT在PCA-g-PCL、DTT的THF溶液中浓度为10mM，搅拌条件下向其中加入催化剂量的CH3Na无水甲醇溶液。25下，反应6h后用Agilent1200凝胶渗透色谱（GPC）测量被降解的PCA-g-PCL共聚物的分子量。由于PCA-g-PCL共聚物具有还原降解性，PCA-g-PCL胶束在加入还原剂的模拟还原条件下（在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入DTT）极有可能是不稳定的。通常，向0.5mlPCA-g-PCL胶束PBS（50mM，pH7.4）溶液中加DTT，控制DTT的加入量使其浓度为10mM。将混合物放置在摇床上，保持37、转速为80rpm。特定时间间隔下，用动态光散射（DLS）测定PCA-g-PCL胶束粒径的变化。2.8 聚离子mPEG PCA-g-PCL胶束的制备为了提高PCA-g-PCL胶束在水溶液中的稳定性，在组装过程中加入 mPEG-COOH，mPEG-COOH通过静电作用与PCA-g-PCL共聚物共价结合。首先，将PCA-g-PCL共聚物、mPEG-COOH分别溶于THF中，轻微震荡混合1h。随后将混合物逐滴加入水中，空气吹扫除去THF。胶束根据mPEG-COOH、mPEG-COOH的摩尔比进行组装（比例在括号内表示），例如mPEGPCA-g-PCL(0.2:1),mPEGPCA-g-PCL(0.5:1) and mPEGPCA-g-PCL(1:1)。通过DLS研究mPEG片段的引入对自组装胶在水溶液中稳定性的影响。将mPEGPCA-g-PCL胶束溶液贮存在37下以观察特定时间间隔教书粒径的变化。载紫杉醇mPEGPCA-g-PCL胶束的制备过程如下：首先，将PTX、PCA-g-PCL共聚物、mPEG-COOH（摩尔比1:1）分别溶于THF，轻微震荡1h进行混合；将混合物逐滴加入水中；通过透析除去THF以在水溶液中制备载药mPEGPCA-g-PCL（1:1）胶束。测定得，载药mPEGPCA-g-PCL（1:1）胶束的载药率和包封率分别为7.8% 和78.6%。2.9 表征用Bruker Avarice TM500NMR波谱仪测定1HNMR谱，样品浓度为35mg/ml在D2O或CDCL3。用Hitachi F-4500激发波长为390nm荧光光谱，以芘作为荧光探针进行荧光测定。用配有示差折光检测器的Agilent1200凝胶渗透色谱（GPC）于35下测量分子量。流动相为THF，流速1.0ml/min，进样体积15L。分子量已知范围较窄的聚苯乙烯为分子量的校准标准。组装胶束的粒径及其粒径分布通过动态光散射仪（Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments, UK）测定。使用透射电镜（TEM）观察组装胶束的形态。将涂有碳膜的铜栅在一滴样品液中浸渍60秒，室温干燥35min，在JEM-100 C II显微镜（LIBRA 120, Carl Zeiss, 德国）下观察。2.10 紫杉醇胶束在体外的释放特性对Opanasopit记载的方法稍作修改研究PTX从mPEGPCA-g-PCL(1:1)的释放特性。将载紫杉醇mPEGPCA-g-PCL(1:1)胶束的磷酸盐缓冲液置于在三种不同环境中浸没30min的截留分子量为3500的透析管中，三种环境分别为：不加DTT的PBS（pH7.4）溶液；含10mM DTT的PBS（pH7.4）溶液；含40 mM DTT的PBS（pH7.4）溶液；温度都为37 0.5。给定时间间隔内，抽出0.5ml等份的透析液并加入相同体积的新鲜透析液。通过紫外-可见光光谱在227nm处的吸收分析样品溶液。每一实验平行三次，结果以平均值和标准偏差来表示（平均值标准偏差）。3.结果与讨论3.1 PCA-g-PCL共聚物的结构及还原降解性胱胺二盐酸盐和乙醇胺通过Michael加成反应生成含有二硫键的阳离子聚合物聚CBA-AEOL（PCA）。聚己酸内酯（PCL）与其接枝形成新型的可还原降解聚合物PCA-g-PCL。合成过程如图.1所示。CBA是胱胺二盐酸盐与丙烯酰氯在Schotten-Baumann条件下反应合成的。用1HNMR谱确定CBA的结构，详细的化学位移如图.2.a所示。在图上峰都位于2.9 ppm (t, 4H, CH2SS),3.7 ppm (t, 4H, CONHCH2), 5.7 ppm (d, 2H, CH2CH), 6.2 ppm (t,2H, CH2CH), 6.8 ppm (d, 2H, CH CH2)。随后，由等摩尔量的CBA和乙醇胺通过Michael加成生成PCA。在机械搅拌下反应十天直至溶液粘稠，再加入10mol%的乙醇胺反应两天以消耗未反应的丙稀酰胺基团。用1HNMR谱(D2O)确定PCA的结构，如图.2b所示，峰值在2.66 ppm (t, 4H, NH2COCH2), 2.77 ppm (t, 4H,SSCH2), 3.16 ppm (t, 2H, CH2CH2OH), 3.31 ppm (t, 4H, NCH2CH2CO),3.44 ppm (t, 4H, SSCH2CH2), 3.79 ppm (t, 2H, CH2CH2OH)。与图.2a中显示的CBA结构相比，图.2b中5-7ppm信号的消失表明在PCA的结构中不存在端基丙烯酰胺结构。并且测得PCA的平均分子量（Mn）和多分散性指数（PDI）值分别为3.42104。在110下，PCA为引发剂，Sn（Oct）2为催化剂进行-CL 开环聚合反应聚合生成特定结构的PCA-g-PCL。通过GPC测得PCA-g-PCL聚合物的Mn与PDI值分别为17.20 104 、3.89。用1HNMR谱确定PCA-g-PCL聚合物的结构，详细化学位移见图.2c。在室温下，在甲醇钠为催化剂、DTT为还原剂的THF溶液中研究PCA-g-PCL聚合物的还原降解行为。由图.3 GPC曲线所示，峰向洗脱时间长的一边移动表明因PCA-g-PCL聚合物中二硫键的断裂导致其分子量的降低。PCA-g-PCL聚合物的降解产物呈现单峰分布，平均分子量与PDI值分别为1.69 104、1.80。（图.3）3.2 PCA-g-PCL胶束的形成及其还原敏感性能通过透析的方法进行PCA-g-PCL胶束的制备，以芘作为探针测定其临界胶束浓度。绘制芘激发光谱的强度比I339/I337与PCA-g-PCL聚合物对数浓度图，I339/I337强度比开始增加的其实浓度即为CMC。测得PCA-g-PCL聚合物的CMC为1.75mg/L。当PCA-g-PCL聚合物浓度高于临界胶束浓度时，通过DLS观察到PCA-g-PCL胶束的平均粒径为108nm切粒径分布较窄（图.4）。由于粒径合适，可利用EPR效应靶向肿瘤细胞。图.4的透射电子显微镜图显示了观察尺寸在50nm时PCA-g-PCL胶束是呈球形的。此种情况下，用TEM测定比用DLS测定会使得组装胶束在蒸发后收缩。PCA-g-PCL共聚物中的二硫键使组装胶束具有还原敏感性。在含10mM DTT 的PBS的还原性条件下，通过DLS检测组装胶束粒径的改变。如图.5所示，PCA-g-PCL胶束的粒径分布曲线在10mM还原性条件下变大了，同时粒径也变大了。相比之下，未加DTT的对照组中的PCA-g-PCL胶束的粒径24h后只有较小的增加。这表明，PCA-g-PCL胶束在模拟生理pH下可以稳定存在。3.3 PEG交联PCA-g-PCL胶束的制备具有羧基端的聚乙二醇甲基醚mPEG-COOH通过静电作用与PCA-g-PCL共聚物的N-H共价共价连接。由于亲水片段PEG形成了胶束的外壳使得胶束在水溶液中稳定性增加。图.6显示了不同mPEG-COOH、PCA-g-PCL摩尔比形成的mPEGPCA-g-PCL的TEM图。TEM图显示mPEGPCA-g-PCL胶束是典型的球形纳米粒子。同时，图.7中沿时间轴的起始点显示mPEGPCA-g-PCL(0.2:1), mPEGPCA-g-PCL(0.5:1)，mPEGPCA-g-PCL(1:1)的平均直径分别为97、92、85nm（通过DLS测定）。mPEG-COOH、PCA-g-PCL摩尔比越高，组装胶束的平均粒径就越小。与使用DLS测定相比较，用TEM测定的粒子尺寸较小，原因是在制备TEM样品的过程中由于脱水、蒸发引起组装胶束的解体和在TEM测定中亲水性PEG壳的隐藏性行为。而且，通过DLS手段测定载药mPEGPCA-g-PCL（1：1）胶束的平均直径为88nm，这与未载药空白胶束的粒径相近。值得注意的是：通过DLS手段测定的自组装mPEGPCA-g-PCL胶束粒径大多都小于200nm，这就表明了它是可以作为一种合适的进入肿瘤组织的载体。通过DLS测定PEG与组装胶束共轭连接后对其在水溶液中稳定性的影响。图.7表示在37的PBS溶液中mPEGPCA-g-PCL和PCA-g-PCL胶束粒径的变化。虽然PCA-g-PCL胶束粒径在24h下不变，但是在2天后发现胶束粒径有明显的增加，随着贮存时间的增加PCA-g-PCL胶束的聚集效应就越严重。相