家蝇幼虫抗菌蛋白对子宫内膜癌细胞生长影响.doc

家蝇幼虫抗菌蛋白对子宫内膜癌细胞生长影响*【摘要】目的探讨家蝇幼虫抗菌蛋白对子宫内膜癌细胞(JEC)的影响。方法细胞计数法、四甲基偶氨噻唑蓝(MTT)法测定家蝇幼虫抗菌蛋白对JEC细胞生长的影响；MTT法测定家蝇幼虫抗菌蛋白对正常人牙周膜细胞生长的影响；苏木素一伊红(HE)染色法观察细胞凋亡，并计算细胞凋亡指数(AI)。结果高浓度组JEC细胞数及吸光度(A)值明显降低，细胞增殖抑制率随浓度的增加而增大；各浓度组正常人牙周膜细胞的A值和细胞增殖抑制率与对照组比较差异均无统计学意义；HE染色见细胞凋亡，各浓度组AI均明显高于对照组。结论家蝇幼虫抗菌蛋白可能是通过诱导细胞凋亡来抑制JEC细胞生长。 【关键词】 家蝇幼虫 抗菌蛋白 子宫内膜癌细胞(JEC)Effect of antibactrial proteins from the Musca dometica larvae on the growth of JECHE Lifang,WAN Qihui,LIU Hui,et al.Departement of Parasitology,Zunyi Mediical College(Zunyi 563003,China) Abstract： Objective To explore the effect of antibactrial proteins from the Musca domestica larvae on the JEC.Methods The effect of the antibactrial proteins from the Musca dotestlca larvae on the gowth of the JEC were observed by cytometry,MTT assay,and its effect on the growth of periodontal membrane cell of human were observed by MTT assay.The morphology of apoptosis cells was observed with hematoxylin-eosin stainings,and the apoptosis index(AI) was measured.Results At high-concentration groups,the cell number and the optical density(OD) of JEC were significantly decreased and with the increase of the concentration,the inhibitory rate of the cell proliferation was increased.The OD and the inhibitory rate of the cell proliferation at the all-concentration groups hadno significant difference compared with the coatrol group in the periodontal membrane cell of human.Compared with control group,the apoptosis index(AI) were significanltly increased in all concentration groups.Conclusion The antibactrial proteins from the Musca domestica.larvae may be inhibited the growth of JEC by inducing the apoptosis of cell. Key words：mords Musca domestica larva;the antibactrial proteins;JEC研究表明，昆虫抗菌物质能特异性地抑制某些肿瘤细胞生长1，而对正常人体细胞无不良影响2。但其抗肿瘤作用机制仍未完全清楚。本研究利用家蝇幼虫抗菌蛋白作用于子宫内膜癌细胞(JEC)，探讨家蝇幼虫抗菌蛋白抗肿瘤作用机制，为开发利用昆虫资源进行肿瘤治疗提供实验依据。1 材料与方法1.1 主要材料及试剂 子宫内膜癌细胞(JEC)；牙周膜细胞。RPMI-1640和胎牛血清(DMEM)培养基(美国Sigma公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(美国AMRESCO公司)；酶标仪(美国ELX-800及DJ302A)。1.2 家蝇幼虫抗菌蛋白的诱导、提取及无菌处理 取家蝇三龄幼虫数百条热诱导(65，1min，室温放置10min，重复3次)，然后于65，5min，室温放置1h。80热水快速烫死，制备组织匀浆(在2的2-巯基乙醇中)，100水浴5min，410000r/min，离心30min，取上清抽滤除菌，-20保存备用。1.3 实验分组 实验组(家蝇幼虫抗菌蛋白组)分0.02，0.1，0.5，2.5及12.5组。对照组为等量培养基，各组设4个平行孔。JEC用含10新生牛血清的RPMI-1640培养基，牙周膜细胞用含10新生牛血清的DMEM培养基，于37、5CO2培养箱中培养。1.4 细胞计数法测细胞生长曲线 24孔板接种细胞，24h后加入含不同浓度家蝇幼虫抗菌蛋白的培养基，对照组加等量的培养基。48h后细胞计数器测细胞数(个ml)。1.5 MTT法测细胞增殖抑制率 96孔板中接种细胞培养，24h后加入含不同浓度家蝇幼虫抗菌蛋白的培养基，对照组加等量的培养基。48 h后于各孔加入10μl MTT(5mg/ml)，4h后加二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，充分混匀后于酶标仪上测630nm、570nm波长的吸光度(A)值。A570-A630为最终计算值，代入公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率()=(1-实验组A值对照组A值)×100。1.6 HE染色法 接种细胞于有盖玻片的6孔板中，24h后加入含不同浓度家蝇幼虫抗菌蛋白的培养基，对照组加等量的培养基。24h后取出盖玻片，HE染色法观察细胞凋亡。计算细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)3：AI=凋亡细胞数总细胞数×100。1.7 统计分析 应用SPSS软件进行配伍设计的方差分析和t检验。2 结果2.1 细胞计数法测细胞生长曲线 家蝇幼虫抗菌蛋白低浓度组(0.02和0.1组)细胞数与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)；而在高浓度组，细胞在生长初期就受到抑制，随着作用时间延长，细胞很快死亡(图1)。2.2 MTT法测细胞增殖抑制率 在JEC细胞中加入不同浓度家蝇幼虫抗菌蛋白，A值在低浓度组未见明显变化(P0.05)，而在高浓度组(2.5和12.5组)却显著下降(P0.05)(表2)。2.3 HE染色 高浓度组可见典型凋亡细胞，还可见凋亡小体。AI检测发现，家蝇幼虫抗菌蛋白作用后，各浓度组JEC细胞凋亡指数均明显高于对照组(P0.01)，且随浓度的递增而逐渐升高(图2)。图1 家蝇幼虫抗菌蛋白对JEC细胞生长的影响（略）注：12.5组，箭头所指为凋亡细胞。图2 家蝇幼虫抗菌蛋白诱导JEC细胞凋亡（略）表1 家蝇幼虫抗菌蛋白对JEC细胞增殖的抑制作用（略）注：与对照组相比较，* P0.05。3 讨论 细胞增殖与细胞凋亡的平衡失调即引起癌变4。肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞能否逃避凋亡有关，肿瘤细胞凋亡的诱导是治疗肿瘤的一个重要途径。表2 家蝇幼虫抗菌蛋白对牙周膜细胞增殖的抑制作用（略）通过细胞计数法、MTT法对JEC细胞生长的观察发现，在高浓度组，细胞在生长初期就受到抑制，随着作用时间延长，细胞很快死亡，家蝇幼虫抗菌蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制率也增加。这种作用在低浓度范围内，对癌细胞无明显的抑制作用，只有达到一定的阈值，才有明显的抑制作用，且随作用时间延长，抑制作用逐渐增强，最终导致肿瘤细胞死亡。对正常人牙周膜细胞增殖基本无抑制作用。由此可见，家蝇幼虫抗菌蛋白对JEC细胞增殖有抑杀作用，而对正常人体细胞无影响。据报道5，经抗菌蛋白CM4组分作用的K562细胞生K562动态观察，发现高浓度的抗菌蛋白能抑制K562细胞生长，细胞很快死亡；而低浓度组作用的细胞，其生长在初期受抑制，随着作用时间的延长，细胞生长正常；提示抗菌蛋白CM4抑制肿瘤细胞生长的作用也可能存在一个阈值。与本实验结果相一致，其他研究也得到证实6-8。 HE染色见JEC凋亡细胞数增多，AI随抗菌蛋白浓度的递增而逐渐升高。结合本研究前期实验结果9，流式细胞仪检测显示，高浓度组JEC细胞凋亡率明显升高，由此推测，家蝇幼虫抗菌蛋白可能通过某些途径诱导JEC细胞凋亡而抑制其生长。【参考文献】 1文彩虹，曲传智，李东英，等.家蝇免疫血淋巴对SMMC-7721肝癌细胞超微结构和增殖周期的影响J.河南肿瘤学杂志，2004，17(2)：100-101.2胡云龙，郭玉梅，钱万红，等.抗菌肽抑制肿瘤细胞的实验研究J.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(4)：320-322.3Soini Y，Paakko P，Lohto V P.Histopathological evalution of apoptosis in cancerJ.A M J Pathol，1998，53(4)：1041-1053.4Korsmeyer S J.Bcl-2 initiates a new category of oncogenes：regulators of cell deathJ.Blood，1992，80(4)：879-886.5王芳，张双全，杨伟平.抗菌肽CM组分对离体癌细胞的影响J.南京师大学报：自然科学版，1998，21(4)：53-57.6赵东红，张双全，戴祝英，等.天然家蚕抗菌肽对人白细胞及巨噬细胞淋巴瘤细胞骨架系统作用的比较J.南京师大学报：自然科学版，2000，23