大肠杆菌感受态细胞的制备ppt课件.ppt

大肠杆菌感受态细胞的制备 1 实验目的 1 熟悉感受态细胞制备原理 2 掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法 2 3 实验原理 在自然条件下 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 但在人工构建的质粒载体中 一般缺乏此种转移所必需的基因 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移 如需将质粒载体转移进受体细菌 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 经一定的理化方法诱导后 处于适于摄取和容纳外源DNA的细胞 称为感受态细胞 4 目前 制备感受态细胞已成为基因操作的常规技术 感受态细胞 原核细胞或真核细胞 特点 细胞的通透性在制备过程中增强使其易于接受外源基因 细胞本身应为修饰 限制酶缺陷的菌株 使外源DNA分子不易被切除或破坏 5 制备感受态细胞可以使用电击法或化学法 电击法是利用瞬时高压电流处理细胞悬浮液 使细胞膜发生去极化 产生微孔 悬液中的核酸就可通过微孔进入细胞 电击转化需要仪器帮助化学法则更加简便 尤其适用于原核细胞感受态制备 6 大肠杆菌感受态制备 RuCl法CaCl2法其原理是细胞在低温 低渗CaCl2 0 1M 作用下 会发生膨胀 Ca2 使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构 促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来 诱导细胞成为感受态细胞 转化时混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物粘附于细胞表面 通过热刺激 液晶态细胞膜表面产生裂隙 使外源DNA进入细胞 7 操作步骤 细菌接种与培养取 70 冰冻大肠杆菌DH5 菌种 用划线法接种细菌于培养皿 做好标记 于37 培养过夜 第二天 从平板上挑取单个菌落 接种至含有3mlLB培养液的试管中 37 振荡培养过夜 次日取菌液30 L接种至含有3mlLB培养基的试管中 37 剧烈震荡培养约2 3小时 200 300r min 8 菌体收集当菌落600nmOD值达到0 3 0 4时 将试管取出放置冰上10 15分钟 在无菌条件下 取1ml菌液装入1 5ml离心管中 4 5000rpm离心5min 弃上清 将管倒置于干滤纸上1min 吸干残留的培养液 9 制备感受态 1 加200 L冰预冷的0 1MCaCl2到离心管中 振荡混匀 使菌体悬浮 冰浴30min 2 4 5000rpm离心5分钟 弃上清 将管倒置于干滤纸上 吸干残留液体 3 加50 L冰预冷的0 1M的CaCl2 重悬浮菌体 放至4 保存备用 24 48小时内使用效果较好 如果暂时不用 可加入等体积的30 的甘油 甘油终浓度为15 混匀 液氮速冻后保存于 80 低温冰箱中待用 可保存半年以上 10 注意事项 细胞的生长状态和密度最好从 70 或 20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 不要用已多次转接 或贮存在4 的培养菌液 应用对数期或对数生长前期的细菌 可通过测定培养液OD600控制 DH5 菌株的OD600为0 5时 细胞密度在5 107个 ml左右 过高或不足均会使转化率下降 11 注意事项 防止污染整个操作过程均应在无菌条件下进行 所用器皿 如离心管 移液枪头等需要经高压灭菌处理 所有的试剂都要灭菌 并注意防止被其它试剂 DNA酶