实验二青霉素发酵综合实验.doc

实验二 青霉素发酵综合实验（七） 发酵罐的操作及控制实验目的1、学习发酵过程中发酵控制、取样、流加等一般操作过程。2、了解和学习自动发酵罐的操作过程和注意事项。实验原理一、发酵控制（一）发酵温度的控制1、一般来说，接种后应适当提高培养温度，以利于孢子的萌发或加快微生物的生长、繁殖，而且此时发酵的温度大多数是上升的。随着发酵液的温度逐渐上升，发酵液的温度应该控制在微生物的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段温度的控制可比最适生长温度低些，即控制在微生物代谢产物合成的最适温度；到发酵的后期，温度出现下降的趋势，直至发酵成熟即可放罐。2、工业发酵过程一般无须加热，因为释放的发酵热常常超过微生物的最适生长温度，所以需要冷却阶段较多。通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温（如采用夹套或蛇形管进行调温），冬季发酵时空气还需进行加热处理，以便维持发酵的正常温度。（二）发酵pH值控制首先应根据不同微生物的特性，不仅要控制原始培养基的pH值，而且在整个发酵过程中，必须随时检测pH值的变化情况，根据发酵过程中的pH值变化规律，选用适当的方法对pH值进行调节和控制。在实际生产中，调节和控制pH值的方法主要有以下几种。1、调节培养基的原始pH值，或加入缓冲溶液（如磷酸盐）制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基，或使眼泪和碳源的配比平衡。2、在发酵过程中加入弱酸或弱碱经行pH值调节，进而合理的控制发酵条件；也可通过调整通风量来控制pH值。3、如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既可调节培养基的pH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物产率。4、采用生理酸性铵盐作为氮源时，可在培养液中加入碳酸钙来调节pH值。但是碳酸钙的加入量一般都很大，在操作上很容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用布氏太广。5、在发酵过程中根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同行又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH值影响波动大，应采用少量多次的流加方法，以免造成pH值过高，从而抑制微生物细胞的生长，或pH值过低，NH4+不足等现象。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH值7.08.0，最好采用自动控制连续流加方法。6、以尿素作为氮源经行流加调节pH值，是目前国内味精厂普遍采用的方法。尿素分解放出氨，使pH值上升；同时氨和培养基中的营养成分被微生物利用后形成有机酸等中间代谢产物，使pH值降低；此时就需要流加尿素，以调节pH值和补充氮源。反复进行流加就可维持一定的pH值。7、目前已有用于发酵过程的pH测量电极，可连续测量并记录pH值的变化，用于控制和检测发酵pH值。（三）提高溶解氧的措施控制溶解氧的工艺手段主要是从供氧和需氧两方面来考虑。影响溶解氧效果的主要因素有：（1）通气流量（通风量）；（2）搅拌速度；（3）气体组分中的氧分压；（4）罐压；（5）温度；（6）温度；（7）培养基的物理性质等。而影响需氧的则是菌体的生理特性，诸如不同菌龄的呼吸强度差别，基质加入时菌丝耗氧的增加等。工艺上主要的控制手段有以下几种方法。1、改变通气速率（增大通风量）改变通气速率主要是通过改变体积溶氧系数KLa来改变供氧能力。有两种情况：A、在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果；B、在空气流速已经十分高的情况下，再增加通气速率，作用便布氏很明显，反而会产生某些副作用，比如泡沫形成、水分蒸发、罐温增加以及染菌几率增加等。2、改变搅拌速度一般来说，改变搅拌速度的效果要比改变通气速率大，这是因为：A、通气泡沫被充分破碎，增加有效气液接触面积；B、液流滞流增加，汽泡周围液膜厚度和菌丝表面液膜厚度减小，并延长了汽泡在液体中的停留时间，因而就较有效的增加KLa，提高了供氧能力。3、改变气体组成中的氧分压用通入纯氧的方法来改变空气中氧的含量，提高了KLa值，因而提供了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的，这种方法在实验室动植物细胞培养中已被采用。其他富氧装置也在开发，但因成本核算问题，离实际规模化应用还有距离。4、改变罐压增加罐压实际上就是改变氧的分压PO2来提高液相氧浓度，从而提高供氧能力，但此法不是十分有效。5、改变发酵液的理化性质在发酵过程中，菌体本省的繁殖及代谢可引起发酵液性质不断改变，例如改变培养液的表面张力、粘度及离子强度等，就会影响培养液中气泡的大小、气泡的溶解性、稳定性以及合并为大气泡的速率。同时发酵液的性质还影响到液体的流动及界面或液膜的阻力，因而显著的影响到氧的溶解速度，而且由于发酵液中菌丝浓度所引起的表观粘度的增加，可使通气速率下降。如果培养基性质为限制氧传递的因素时，就根据具体情况对培养液的某一物理性质稍作改造，例如加消泡剂、补加无菌水、改变培养基成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生长。（四）二氧化碳浓度控制1、CO2在发酵液中的浓度变化受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度；罐压大小、设备规模等。对CO2浓度的控制主要看其对发酵的影响，如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之应设法降低其浓度。2、通过提高通气量和搅拌速率，在调节溶解氧的同时，还可以调节CO2的浓度，通气使溶解氧保持在临界值以上，CO2又可随着废气排出，使其维持在引起抑制作用的浓度之下。3、降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。4、CO2的产生与补料控制有密切关系。（五）泡沫的控制1、泡沫产生的原因通气和搅拌、培养基成分、培养基的灭菌方法、培养液的温度、酸碱度、浓度等对发酵过程的泡沫形成也有一定的影响。2、泡沫的消除和防止了解发酵过程中泡沫的消长规律，方可有效的控制泡沫。消除和控制泡沫的方法主要包括化学消泡和机械消泡两种方法，同行司还可以考虑从减少起泡物质和产泡外力着手（如起泡物质多为表面活性物质，可以适当予以减少；通气使氧的含量达到临界值即可，不一定要达到饱和度）。（1）化学消泡其优点是化学消泡剂来源广泛，消泡效果好，作用迅速可靠，尤其是合成消泡剂的效率更高，用量少，不需要改造现有的生产设备，不仅适用于大规模发酵生产，同时也适用于小规模的发酵实验。这是目前应用最广的一种消泡方法。工业上常用的化学消泡剂种类：天然油脂类、高级醇类、聚醚类（生产上应用较多的有聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油等，它们以一定比例配制的消泡剂又称“泡敌”，消泡能力是天然植物油的10倍以上）、硅酮类、氟化烷烃。（2）机械消泡机械消泡不同于化学消泡，它是靠强烈机械振动和压力的变化，促使气泡破裂，或借助于机械力将气体中排出的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。A、罐内机械消泡包括耙式消泡桨的机械消泡、旋转圆板式的机械消泡、流体吹入式机械消泡、冲击反射板机械消泡、超声波消泡、碟片式消泡器的机械消泡。B、罐外机械消泡包括旋转叶片罐外机械消泡、转向板消泡、喷雾消泡、离心力消泡、旋风分离器消泡。二、抗生素发酵控制发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接种量一般为10%或10以上，发酵期视抗生素品种和发酵工艺而定。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧，在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。此外，还要加入消泡剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。对有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或嵌体，以促进抗生素的产生。对其中一些主要发酵参数可以用电子计算机进行反馈控制。在发酵期间每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形状和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。其中有些项目可以通过在线控制。青霉素发酵控制具体包括以下几个方面。1、加糖控制加糖的控制主要根据产糖即发酵过程中的pH，或最好是根据排气中CO2及O2的量来控制。一般在残糖量降至0.6%左右，pH上升时开始加糖。2、补氮及加嵌体补氮是指加硫酸铵、氨或尿素，使发酵液氨氮控制在0.01%0.05%。补前体以使发酵液中参与苯乙酰胺浓度为0.05%0.08%。3、pH控制对pH的要求视不同菌种而已，一般为6.46.6。可以加葡萄糖来控制pH。当前趋势是加酸或碱自动控制pH。4、温度控制一般前期为2526，后期为23，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。5、通气与搅拌抗生素深层培养需要通气与搅拌，一般要求发酵液中溶解氧含量不低于饱和情况下溶解氧的30%。通气比一般为1：0.8VVM。搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。6、泡沫与消泡在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡。应当控制其用量并少量多次加入，尤其在发酵前期不宜多用，否则会影响菌的呼吸代谢。方法步骤（一）发酵培养1、通气量的调节要加大通气量，则需调大进气阀F13，反之则调小进气阀F13的开度；阀F14要作出相应调整，以保持罐压。通气量的测量：通过流量计进行检测。青霉素发酵过程中通气量一般为1：11：0.8VVM。2、发酵温度、pH、转速、流加控制、消泡等各参数的调整按照“DF-BIC控制系统或发酵罐过程控制系统的操作说明”所述方法进行调整。将控制器设置至“开机”状态，并分别按“加热”、“冷却”、“搅拌”键，使之置于“自动”状态。此时，各参数进入自动控制，并根据记录周期所定的时间进行各参数的记录。如果在自动控制过程中某参数出现过调或调不到所需值，则需调整该参数设定值中的“开度”。如果过调，则需减小“开度”值；如果调不到所需值，则需加大“开度”值。青霉素发酵温度设定在23，pH控制在6.46.6，流加氨水溶液控制；消泡自动控制；转速待定。3、DO电极的满度校正当温度、通风量、罐压、搅拌转速稳定后，将此时的DO值校正为100%。4、将预先准备好的碱液和灭过菌的消泡剂、流加物料及硅胶管与蠕动泵及发酵罐（将针插入发酵罐备用口）联接好；注意操作过程中必须保持无菌。5、打开“pH”、“消泡”、“流加”开关，将手动、自动开关置于“自动”位置。此时，上述参数进入自动控制。6、取样测定发酵过程中还原糖含量、青霉素效价、酸碱度等指标。取样步骤按GUJS-10说明进行。（二）单片机控制GUJS-10型搅拌发酵系统配备了先进的自动控制系统。DF-BIC控制系统可分为以下两种控制。1、自动控制（1）打开单片机确定运行状态为开机状态。（2）打开单片机的主界面，进入参数设定，选定所需要设定的参数，最常用的是温度、pH值、DO值、搅拌机速度等。将所设定数据输入单片机后，按下回车键，单片机进入设定状态，否则输入无效。（3）返回主界面，将所有的已设定参数中能够使该参数上升或减少（双向控制）的功能键均打开，并处于绿色指示灯状态。如温度的设定：将升温和降温同时打开为绿灯指示，使之处于自动控制状态。注意：自动控制必须是在双向控制均存在时才起作用。2、手动控制（1）打开单片机确定运行状态为开机状态。（2）将双向控制键设定于红灯状态下，此时处于手动状态。（3）将双向控制键中能达到你需要参数数据的键，当屏幕显示