Angiopep_2修饰核_壳介_省略_化硅脂质囊纳米粒的制备及体外评价_王国伟.pdf

基金项目 国家自然科学基金资助项目 81274089 81473361 浙江省自然科学基金资助项目 LZ13H280001 作者简介 王国伟 男 硕士研究生研究方向 新型递药系统及靶向制剂研究 通讯作者 李范珠 男 教授 博士生导师研究方向 药物新剂型与新技术研究Tel 0571 86633030 86613607E mail lifanzhu zcmu edu cn Angiopep 2 修饰核 壳介孔二氧化硅脂质囊纳米粒的制备及体外评价 王国伟 费伟东 张蓉蓉 郭曼曼 徐骏军 李范珠 浙江中医药大学药学院 杭州 310053 摘要 目的制备 angiopep 2 修饰核 壳结构介孔二氧化硅脂质囊纳米粒 ANG MSN LP 并进行体外评价 方法采用 Stober 法制备介孔二氧化硅纳米粒 MSN 改进了溶液吸附法来制备载紫杉醇 PTX 的介孔二氧化硅纳米粒 MSN PTX 然后以载紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒为核 运用自组装和薄膜水化法构建核 壳结构的 angiopep 2 修饰介孔二 氧化硅脂质囊纳米粒 ANG MSN LP PTX 透析袋法考察体外释药特性 噻唑蓝 MTT 法考察载体对人脑微毛细血管 内皮细胞 HBMEC 和 C6 的细胞毒性 建立体外血脑屏障 BBB 模型研究载体对紫杉醇的跨膜转运能力和对 C6 细胞 周期的影响 结果介孔二氧化硅纳米粒粒径为 94 61 3 91 nm PDI 0 085 0 01 比表面积 SBET 为 425 m2 g 1 孔容积 V p 为 0 37 cm 3 g 1 孔径 3 5 nm 介孔二氧化硅纳米粒在紫杉醇的饱和溶液中反复吸附 7 次时达 到平衡 载药量高达 11 1 Angiopep 2 修饰介孔二氧化硅脂质囊纳米粒分布均一 无团聚现象 具有明显的核 壳结 构 粒径 106 37 3 76 nm PDI 0 14 0 02 并且在 0 10 g mL 1范围内对 HBMEC 和 C6 细胞具有良好的 安全性和生物相容性 Angiopep 2 修饰介孔二氧化硅脂质囊纳米粒体外释药 48 h 内的累积释放率达到 75 5 突释现 象降低 具有明显的缓释特性 跨膜血脑屏障转运 12 h 后 对紫杉醇转运率高达 10 74 在细胞周期实验中 使 C6 细 胞滞留在 G2 M 期细胞数比例为 40 92 6 20 显著高于各对照组数倍 结论 Angiopep 2 修饰介孔二氧化硅脂质 囊纳米粒是一种优良的递药载体并有望应用于脑胶质瘤的治疗 反复饱和溶液吸附法可有效提高药物载药量 值得应 用和借鉴 关键词 介孔二氧化硅 angiopep 2 溶液吸附法 血脑屏障 脑胶质瘤 体外评价 doi 10 11669 cpj 2015 09 010中图分类号 944文献标志码 A文章编号 1001 2494 2015 09 0775 09 Preparation and in Vitro Evaluation of Paclitaxel loaded Core Shell Structural Phospholipid Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles Modified with Angiopep 2 WANG Guo wei FEI Wei dong ZHANG ong rong GUO Man man XU Jun jun LI Fan zhu College of Phar maceutical Science Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou 310053 China ABST ACT OBJECTIVETo prepare and evaluate the novel core shell structural phospholipid functionalized mesoporous silica nanoparticles MSN LP modified with angiopep 2 ANG MSN LP METHODSMesoporous silica nanoparticles MSN was syn thesized by the modified Stober method MSN PTX was prepared by saturated solution adsorption method ANG MSN LP was developed by selfassembly and film hydration method By using dialysis bag method to investigate the in vitro drug release characteristics and MTT method to investigate the cytotoxicity on HBMEC and C6 cells The transport ability and effects on cell cycle of the carrier was investi gated by the BBB monolayer model ESULTSMSN was synthesized with high specific surface area SBET 425 m2 g 1 cumula tive pore volume Vp 0 37 cm3 g 1 and pore size 3 5 nm PTX was highly encapsulated drug loading efficiency up to 11 1 into MSN esults of in vitro release showed that about 75 5 of PTX released from ANG MSN LP PTX after 48 h and burst release was effectively reduced compared with MSN PTX or PTX solution indicating pronounced sustained release characteristics The good biocompatibility and low toxicity of ANG MSN LP were evaluated by HBMEC and C6 cells The transport ratio was 2 49 for PTX 2 72 for MSN PTX 4 45 for MSN LP PTX and 10 74 for ANG MSN LP PTX respectively In addition ANG MSN LP PTX showed a higher cell number of G2 M phase of 40 92 6 20 CONCLUSIONANG MSN LP is a prospective targeting drug deliv ery system for therapy of brain glioma Meanwhile saturated solution adsorption method can increase the drug loading efficiency highly KEY WO DS mesoporous silica nanoparticles angiopep 2 saturated solution adsorption method blood brain barrier brain glioma in vitro evaluation 577 中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9 脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤 为 35 岁以下成 人癌症死亡的第二大原因 占原发性中枢神经系统肿 瘤40 以上 1 2 由于传统的手术切除不能防止癌 细胞扩散入侵周围的正常组织 必须以药物治疗辅 助 然而由于血脑屏障 BBB 的限制 化疗药物很难 有效进入脑内病灶 2 基于纳米技术的不断发展 受 体介导的纳米载体能够促进化疗药物递送入脑 特别 是低密度脂蛋白受体相关蛋白 L P 受体 L P 受体 在 BBB 上高度表达 可介导多种配体的跨 BBB 转 运 3 4 Angiopep 2 TFFYGGS GK NNFKTEEY 相 对分子质量 2400 为 L P 受体的配体 在体内外 BBB 模型和原位脑灌注中均有较高的脑渗透性 并且 L P 受体也在脑胶质瘤细胞表面大量表达 angiopep 2 同 时发挥对脑胶质瘤细胞的二级脑靶向功能 广泛用于 修饰纳米载体使其成为脑靶向递药系统 5 6 介孔二氧化硅 mesoporous silica nanoparticles MSN 自 1992 年由 Stober 发现以来 由于具备巨大 的比表面积和比孔容 可调的孔径和形状 易于修饰 的内外表面和良好的生物相容性 使其成为最有前 途的药物载体之一 7 但是 MSN 团聚严重 分散 性低 靶向能力差 载药易突释 极大阻碍了其应用 和发展 8 脂质体具有良好的跨 BBB 转运的能力 但是存在载药量低 易于泄漏缺点 脂质包裹后的 介孔二氧化硅脂质囊纳米粒 MSN LP 不仅可以减 少突释现象 还可以降低在溶液中的团聚现象 在生 理环境中减少与蛋白质的非特异性结合 提高稳定 性 9 并且 MSN LP 表面脂质易于修饰可以达到靶 向递药的目的 10 但是 目前还没有 MSN LP 用于 脑部递药及脑胶质瘤治疗的相关研究报道 本实验拟制备 angiopep 2 修饰的核 壳结构介 孔二氧化硅脂质囊纳米粒 ANG MSN LP 以抗肿 瘤药紫杉醇 paclitaxel PTX 为模型药 通过体外评 价 初步研究此递药系统对脑胶质瘤的治疗作用 为 脑胶质瘤的治疗提供实验参考 1材料和方法 1 1材料及仪器 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 99 正硅酸 乙酯 TEOS 98 三甲苯 TMP 98 上海阿拉 丁试剂有限公司 PTX 南京泽朗医药科技有限公 司 angiopep 2 Angiopep 2 修饰二硬脂酰磷脂酰聚 乙二醇 DSPE PEG ANG 杭州中肽生化有限公 司 二硬脂酰磷脂酰胆碱 DSPC 二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺 DSPE 胆固醇 上海艾韦特医药科技有 限公司 二硬脂酰磷脂酰聚乙二醇 DSPE PEG 二硬脂酰磷脂酰马来酰亚胺聚乙二醇 DSPE PEG MAL 美国 Laysan 生物科技有限公司 细胞周期 和细胞凋亡检测试剂盒 美国 BD 公司 0 25 胰 蛋白酶 D Hanks 缓冲液 美国 Gibco 公司 DMEM 培养基 含有 4 5 g L 1葡萄糖 3 7 g L 1碳酸氢 钠 10 胎牛血清 1 非必需氨基酸 1 谷氨酰胺 100 u mL 1青霉素和100 g mL 1链霉素 杭州 吉诺生物医药技术有限公司 四甲基偶氮唑盐 MTT 辣根过氧化物酶 H P 和二甲亚砜 DM SO 美国西格玛有限公司 其他试剂均为分析纯 Waters 高效液相色谱仪 美国 Waters 公司 Nano ZS 90 激光粒度分析仪 英国 Malvern 仪器有 限公司 Optima MAX 超速低温离心机 美国 Beck man Coulter 有限公司 Mill Q 超纯水仪 美国 Millpore 公司 pH 酸度计 瑞士 Mettler Toledo 公 司 HT7700 透射电子显微镜 日本日立公司 Vector 22 傅立叶红外光谱仪 德国 B UKE 公 司 T ISTA 3020 全自动比表面和孔隙分析仪 美 国 Micromeritics 仪 器 公 司 igaku D max 2550PC 全自动多晶 X 射线衍射仪 日本理学电机 株式会社 FACSCalibur 流式细胞仪 美国 BD 公 司 Thermo Forma 超低温冰箱 美国 Thermo Fisher Scientific 公司 TGL 16B 高速离心机 上海安亭 科学仪器厂 CP225D 电子天平 北京赛多利斯仪 器系统有限公司 SCIENTZ D 超声波细胞粉碎 机 宁波新芝生物科技股份有限公司 DF 101S 集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州科创仪器有限公 司 HZ 9212S 恒温振荡器 太仓市科教器材厂 1 2细胞 C6 细胞和人脑微毛细血管内皮细胞 HBMEC 浙江中医药大学实验动物中心 培养于 DMEM 培 养基 含有 4 5 g L 1 葡萄糖 3 7 g L 1 碳酸氢 钠 10 胎牛血清 1 非必需氨基酸 1 谷氨酰胺 100 u mL 1青霉素和 100 g mL 1链霉素 培 养条件 37 5 的 CO2 饱和湿度 90 1 3MSN 的合成 1 0 g CTAB 和 7 0 mL TMP 相继加入含有 3 5 mL 2 M NaOH 溶液的 480 mL 去离子水中 80 剧 烈搅拌2 h 后 快速加入5 0 mL TEOS 继续在80 下剧烈搅拌2 h 静置过夜后用砂芯漏斗抽滤得到细 腻的白色胶状物 将白色胶状物分散到 200 mL 含 硝酸铵的乙醇溶液 NH4NO3 C2H5OH 10 mg mL 1 中 80 回流 4 h 去除模板剂 CTAB 和 TMP 677 Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期 得到的产物冷却到室温后 离心 18 000 r min 1 10 min 得到白色固体 将离心得到的白色固体继 续分散到 200 mL 的硝酸铵乙醇溶液中 80 回流 4 h 经过 6 次反复操作彻底去除模板剂 最后一次离 心得到的白色固体于 45 下真空干燥 12 h 即得到 白色粉末状 MSN 1 4溶液吸附法制备 MSN PTX 为了提高 PTX 的载药量 本实验在溶液吸附法 基础上 发明了反复饱和溶液吸附法 称取一定量 MSN 记为 m10 分散到 PTX 的饱和乙醇溶液中 搅 拌2 h 同时每隔 10 min 短时超声 1 min 然后 18 000 r min 1离心30 min PTX 饱和溶液重复利用 将离心 得到的白色固体 MSN PTX 45 减压干燥 12 h 后称 重 记为 m11 然后重复分散 吸附 超声 离心 干燥 称重 每重复一次的称重分别记为 m12 m13 m14 同样 称取一定量 MSN 记为 m00 分散到不含 PTX 的 乙醇溶液中 同法操作 分散 吸附 超声 离心 干燥 称重 每次称重分别记为 m01 m02 m03 载药量i m1i m0i m1i 100 i 1 2 3 4 1 5ANG MSN LP PTX 的制备 ANG MSN LP PTX 的制备采用自组装和薄膜水 化法 称取 DSPC DSPE PEG DSPE PEG ANG 胆固 醇 65 8 2 25 脂质材料适量 置于梨形瓶 40 下 超声溶解于少量三氯甲烷中 加入 MSN PTX 脂质材 料重量的20 快速涡旋分散后 40 下旋转蒸发 成膜 梨形瓶壁上可见透明薄膜和包裹分散在其中的 细小颗粒 然后用 PBS pH 7 4 溶液水化超声得到 混悬液 经葡聚糖凝胶柱 G 100 纯化分离空白脂质 体后得到 ANG MSN LP PTX 除了不加入 DSPE PEG ANG 脂质材料 MSN LP PTX 同法制备 1 6纳米粒的表征 采用透射电镜分别对除模板剂之前和之后的 MSN MSN LP 和 ANG MSN LP 进行观察 粒径仪测 定粒径分布和电位 氮气吸附仪绘制氮气吸 脱附曲 线 BET 法计算比表面积 BJH 模型计算孔径分布 X 射线衍射仪分析 MSN 的 X 射线衍射行为 热重分 析仪测定载药量 1 7体外释药考察 采用透析袋法测定 ANG MSN LP PTX 的体外 释药特性 释放介质为 PBS 溶液 pH 7 4 乙醇体积 分数20 将一定量的 ANG MSN LP PTX 转移入 透析袋中 截留相对分子质量 7 000 透析夹封口 后放入装有500 mL PBS 的烧杯中 然后置于37 100 r min 1恒温水浴震荡器中 平行操作3 份 于 15 30 45 60 min 2 4 6 8 12 24 48 h 时间点吸取 0 5 mL 的透析液 用 0 45 m 微孔滤膜过滤后 续 滤液经 HPLC 测定 PTX 浓度 计算累计释放率 每 次吸取透析液后 添加同温等量的空白 PBS 介质 同法考察 PTX 溶液 MSN PTX 和 MSN LP PTX 的体 外释药特性 1 8细胞毒性和体外抗肿瘤评价 C6 细胞和 HBMEC 细胞用于评价 MSN MSN LP 和 ANG MSN LP 的细胞毒性 C6 细胞还用于 PTX 溶液 MSN PTX MSN LP PTX ANG MSN LP PTX 的抗肿瘤研究 采用 MTT 法检测细胞活性 细 胞接种于 96 孔板 每孔每 100 L 1 105个 稳定 贴壁后待用 分别加入不同浓度的纳米粒或载药纳 米粒 平行 6 个复孔 培养48 h 后 每孔加入 5 mg mL 1的 MTT 溶液 10 L 微量振荡器上振荡 3 5 min 继续培养4 h 弃上清液 加入 DMSO 150 L 在 微量振荡器上振荡 10 min 用酶标仪测定其 570 nm 波长处光密度 OD 值 取 6 个孔的平均 OD 值计 算细胞的存活率 IC IC 实验组 OD 值 空白对 照组 OD 值 100 1 9体外跨 BBB 转运研究 按照文献 11 12 建立体外 BBB 模型 HBMEC 接种于 12 孔 transwell 板 膜嵌套直径 12 mm 平均 孔径 3 m 比表面积 1 12 cm2 美国康宁公司 细 胞密度1 105个 孔 培养3 天后 用细胞跨膜电阻 仪 美国 Millipore Millicell ES 监控并检测跨细胞 电阻 只有细胞单层跨细胞电阻超过 200 cm2才 能用于实验研究 选用 D Hank s 缓冲液作为转运介质研究跨膜 转运率 实验时用预先 37 保温的 D Hanks 溶液冲洗供体池 3 次 在供体池中分别加入含 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 的 DMEM 培养液 终浓度折 PTX 为 1 g mL 1 受 体池中加入空白缓冲液 平行 6 孔 继续孵育 于 1 2 4 8 12 h 在受体池中吸取出100 L 样品 并及时 补充等量空白介质 样品经 HPLC 检测 PTX 浓度 在竞争性实验中 在上述供体池中除了加入各制剂 的 DMEM 培养液外还分别加入了 10 g mL 1 的 angiopep 2 或抑肽酶 继续孵育 4 h 后 从受体池中 吸取 100 L 样品 待测 其他步骤相同操作 1 10细胞周期分析 在细胞周期实验中 将 C6 细胞接种于 12 孔板 中 贴壁稳定后 分别加入 PTX 溶液 MSN PTX 777 中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9 MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 终浓度折 PTX 为 1 g mL 1 平行 6 孔 孵育 48 h 后 胰蛋白酶 消化 1 200 r min 1 离心 5 min 收集细胞 用体积 分数 70 的乙醇溶液 4 固定 8 h 然后在乙醇混 悬液中加入 PBS 轻轻吹散细胞 1 200 r min 1 离 心 5 min 弃去残留的乙醇 然后按照细胞周期检 测试剂盒操作说明进行细胞样品的处理 通过 流式细胞仪检测 运用 FCS Express V3 0 进行数 据分析 为了分析 PTX 制剂跨 BBB 转运后对 C6 细胞 周期的影响 本实验建立了 HBMEC 和 C6 双细胞模 型 按照 1 9 项下操作 建立体外 BBB 模型后 将 Transwell 供体池嵌套膜转移到另一个在受体池中已 接种了 C6 细胞的 Transwell 嵌套板中 形成供体池 嵌套膜上为 HBMEC 构成的 BBB 模型 而受体池底 部为贴壁的 C6 细胞 在供体池中分别加入含 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 的 DMEM 培养液 终质量浓度折合 PTX 为 1 g mL 1 受体池中加入 DMEM 培养液 48 h 后收集 受体池中的 C6 细胞 同法操作进行细胞周期分析 2结果 2 1MSN 的表征 通过 TEM 观察 未除模板剂之前 MSN 聚集现 象严重 图 1A 除模板剂之后 MSN 呈圆整球形 形 态规整 分散性良好 无团聚现象 由于介孔的存在 MSN 表面粗糙 并且高倍镜下可以清晰观察到高度 有序的六角形排列介孔结构 图 1B 经粒径仪测 定后 除模板剂之后 MSN 粒径为 94 61 3 91 nm PDI 0 085 图 2 表 1 测定结果比 TEM 观察到 的略大 可能由于在水相环境中 MSN 表面会形成水 化层而增加粒径 然而 未除模板剂的 MSN 粒径图 出现双峰152 nm 和1 840 nm PDI 0 36 也证明其 存在严重的团聚现象 用 N2吸 脱附等温线分析 MSN 的比表面积和平均孔径 图 3 根据 IUPAC 分 型 该 BET 曲线在相对压力 P Po 0 3 0 7 段明显 符合 IV 型分布 说明 MSN 有均匀的介孔结构 这一 点也可以通过 X D 衍射证明 见图 4 有一个峰形 良好的衍射峰 通过计算可得出 MSN 的比表面积 SBET 为 425 m2 g 1 孔 容 积 Vp 为 0 37 cm3 g 1 孔径 3 5 nm 图 1纳米粒的 TEM 图 A 未除模板剂的 MSN B 除模板剂后的 MSN C MSN LP D ANG MSN LP Fig 1The TEM images of nanoparticles A raw MSN not removed CTAB B MSN C MSN LP D ANG MSN LP 图 2纳米粒的粒径分布图 A 未除模板剂的 MSN B 除模板剂后的 MSN C MSN LP D ANG MSN LP Fig 2Particle size distribution of nanoparticles A raw MSN not removed CTAB B MSN C MSN LP D ANG MSN LP 877 Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期 表 1纳米粒的主要表征参数 n 3 珋 x s Tab 1Main characteristics of particles n 3 珋x s SampleParticle size nmZeta potential mvPolydispersity index aw MSN1 289 54 5620 56 0 860 36 0 033 MSN94 61 3 91 40 10 2 110 085 0 010 MSN LP102 96 2 97 13 63 1 650 16 0 013 ANG MSN LP106 37 3 76 16 57 1 590 14 0 016 图 3N2吸 脱附等温线 A 和孔径分布图 B Fig 3 A N2adsorption desorption isotherms and B pore size distribution of raw MSN and MSN 图 4未除模板剂和除模板剂后 MSN 的 X D 衍射曲线 Fig 4X D pattern of raw MSN and MSN 2 2ANG MSN LP PTX 的制备 以 MSN PTX 为核心 由脂质材料构成的脂质层 通过自组装包裹于 MSN PTX 上 可有效提高其在溶 液环境中的稳定性 并可以阻止包载在 MSN 中的 PTX 扩散释放 并且 DSPE PEG 嵌插在脂质层上 也可能形成 隐形 纳米粒 减少被网状内皮系统的 截留和吞噬 13 由图 1D 可见 ANG MSN LP PTX 圆整球形 粒径均一 无团聚 并且核部分呈现暗色 边缘部分呈现较淡的亮圈 证实核壳结构的构建成 功 与文献 11 14 报道相一致 制备的 ANG MSN LP PTX 粒径 106 37 3 76 nm PDI 0 14 图 2D 表 1 稍大于 MSN 的粒径 脂质层厚约 5 nm MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 之间并没有明显 差异 主要参数相似 图 2C 和表 1 2 3溶液吸附法制备 MSN PTX 改进的溶液吸附法来制备 MSN PTX 由图 5 所 示 随着吸附次数的增加 MSN 的重量不断损失 每 次平均损失率为 3 13 0 45 mg 虽然 MSN PTX 的总重量也是呈现下降趋势 但是 MSN PTX 减去 MSN 的重量却不断增加 图中 MSN PTX i MSNi曲 线 表明随着吸附次数的增加 MSN 载入 PTX 的量 不断增加 每次吸附平均增加载药量为 1 15 0 23 mg 由图还可以看出 吸附 7 次之后 载入药 量基本不变 可以推断 MSN 介孔内对 PTX 的载入 已经接近平衡状态 因此本实验确定了反复饱和溶 液吸附法来制备 MSN PTX 的吸附次数为 7 次 最 后 准确的载药量通过热重分析来计算 加热到 300 后 MSN 和 MSN PTX 分别损失 3 85 wt 和 14 93 wt 两者的差异在于一个是空白 MSN 另 一个则载有 PTX 最终载药量约为 11 1 图 6 2 4体外释药考察 MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 与 PTX 溶液相比 均呈现明显的缓释特性 图 7 PTX 溶液释放迅速 4 h 内的释药量达 98 而 图 5反复饱和吸附次数 重量变化曲线 n 3 珋 x s MSN PTXi 载体吸附饱和药物溶液的吸附次数 载体重量变化曲线 MSNi 载体吸附空白溶液的吸附次数 载体重量变化曲线 MSN PTXi MSNi 载 入载体的药物吸附次数 重量变化曲线 MSNi MSNi 1 载体吸附次数 重量损 失变化曲线 i 1 2 3 4 5 Fig 5Weight of MSN and MSN PTX treated with the increas ing times of adsorption n 3 珋x s MSN PTX i the weight change of PTX loaded in MSN MSN i the weight change of blank MSN MSN PTX i MSN i the weight change of PTX MSN i MSN i 1 the weight change of losing MSN 977 中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9 ANG MSN LP PTX 在 24 h 内 PTX 的累积释药量 为 64 4 48 h 的累积释放量达到 75 5 与 PTX 溶液相比 具有良好的缓释特性 MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 释药特性相似 MSN PTX 在初始 4 h 内突释现象明显 累积释药量达 到 45 6 而 ANG MSN LP PTX 和 MSN LP PTX 的突释现象显著降低 主要得益于 MSN 表面脂 质层的包裹 实验结果证明 脂质层包裹的 MSN 比未包裹的 MSN 具有更明显的缓控释特性和防 突释特性 2 5细胞毒性和体外抗肿瘤评价 MSN MSN LP 和 ANG MSN LP 载体对 HBMEC 和 C6 均表现出较低的细胞毒性和良好的生物相容 性 图8A 8B 在纳米载体浓度达到10 g mL 1 的时 细胞存活率仍在 85 以上 且 3 种载体材料 的细胞毒性在低浓度时并没有显著的差异 当浓度 超过 10 g mL 1 时 MSN LP 和 ANG MSN LP 的 细胞毒性低于 MSN 表明脂质包裹后可以降低细胞 毒性 提高生物相容性 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP 图 6 MSN 和 MSN PTX 的热重分析曲线 Fig 6Thermogravimetric analysis of MSN and MSN PTX 图 7不同 PTX 制剂中 PTX 的体外释药曲线 n 3 珋 x s Fig 7In vitro release profiles of PTX in pH 7 4 PBS contai ning 20 ethanol from PTX formulations by dialysis technique n 3 珋x s PTX 对 C6 细胞的抗肿瘤结果见图 8C C6 细胞活性 随 PTX 浓度的升高而降低 MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 的 IC50分别为 4 7 g mL 1 和 2 1 g mL 1 本实验中暂时无法计算 PTX 和 MSN PTX 的 IC50 因为 PTX 主要作用于微管蛋白 使其团 聚后阻滞细胞分裂 从而抑制细胞增殖 15 然而在 药物作用的 48 h 内 细胞没有表现出明显凋亡状 态 如果延长药物作用时间 由于细胞代谢物的累积 和培养基中营养物质的缺乏也会阻止细胞增殖 并 将严重影响实验结果 实验结果表明 ANG MSN LP PTX 的体外抗肿瘤效果明显高于 PTX MSN PTX 和 MSN LP PTX 2 6体外跨 BBB 转运 建立体外 BBB 模型 考察 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 的跨膜转运能力 跨 膜 BBB 转运 12 h 后 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 的 转 运 率 分 别 为 2 49 2 72 4 45 和 10 74 图 9A 结果表明 脂质 层包裹后可以促进 HBMEC 对纳米粒的转运 同时 angiopep 2 介导可以显著提高纳米粒的跨 BBB 转运 率 在竞争性实验中 如图 9B 所示 通过 angiopep 2 和抑肽酶与 HBMEC 上的 L P 受体竞争性结合 显著 降 低 了 ANG MSN LP PTX 的 转 运 率 证 明 ANG MSN LP PTX 是通过 L P 受体介导的细胞内 吞作用跨 BBB 转运 2 7细胞周期分析 基于 PTX 的抗肿瘤机制 G2 M 期的细胞数 比例为最重要的抗肿瘤参数 15 16 实验组 不同 PTX 制剂组 和空白对照组的差异十分显著 P 0 001 证明实验方法学具有可行性 在 C6 细 胞 中 加 入 不 同 PTX 制 剂 折 合 PTX 1 g mL 1 孵育 48 h 后 MSN PTX 和 MSN LP PTX 对细胞周期的影响略低于 PTX 溶液 PTX 溶液和 ANG MSN LP PTX 结果相似 4 种 PTX 制剂之间 并没有显著差异 图 10A 和表 2 但是 4 种 PTX 制剂跨 BBB 模型后对 C6 细胞周期的影响差 异显著 图 10B 和表 2 PTX MSN PTX 和 MSN LP PTX 组的 G2 M 期的细胞数显著降低 结果分 别 为 12 31 6 28 12 47 3 38 27 07 5 57 而 ANG MSN LP PTX 降低不 明显 G2 M 期 的 细 胞 数 为 40 92 6 20 ANG MSN LP PTX 对 C6 细胞的抑制率显著高于 PTX 溶液 MSN PTX 和 MSN LP PTX 说明其对 C6 具有良好的抗肿瘤效果 087 Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期 图 8MSN MSN LP 和 ANG MSN LP 对 HBMEC A 和 C6 细胞 B 的细胞毒性 PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 对 C6 细胞的肿瘤抑制曲线 C n 6 珋x s Fig 8Cytotoxicity of various complexes on C6 cells or HBMEC cells Viabilities of HBMEC cells A and C6 cells B after treated with MSN MSN LP or ANG MSN LP at a concentration of 0 1 g to 100 g PTX equiv mL 1 for 48 h viabilities of C6 cells after treated with PTX MSN PTX MSN LP PTX or ANG MSN LP PTX at a concentration of 0 01 g to 10 g PTX equiv mL 1 for 48 h C n 6 珋x s 图 9PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 跨 BBB 模型转运率 A Angiopep 2 和抑肽酶对 L P 受体的竞 争性实验 B n 6 珋x s 与 PTX 相比 1 P 0 05 2 P 0 01 Fig 9The transport ratio across the BBB model in vitro of PTX MSN PTX MSN LP PTX and ANG MSN LP PTX at a concentration of 1 g PTX equiv mL during 12 h A The transport ratio across the BBB model in vitro with the com petition assay that the BBB model was conditioned with Angio pep 2 or Aprotinin for 4h respectively B n 6 珋x s 1 P 0 05 2 P 0 01 compared with PTX 3讨论 本实验结合了 MSN 和脂质体的优势 制备了具 有核 壳结构的 Angiopep 2 修饰的二氧化硅脂质囊 纳米粒 可以有效促进 PTX 跨过 BBB 模型而提高对 脑胶质瘤的抑制作用 虽然 MSN LP 和 ANG MSN LP 的粒径略大于 MSN 图 1 和表 1 但是仍控制在 100 nm 左右 有利于 HBMEC 的内吞作用 17 包裹 在 MSN 表面的脂质层可以有效的提高 MSN 的稳定 性 降低突释现象 本实验中 MSN 作为药物载体 在浓度低于 10 g mL 1时 表现出良好的生物相 容性和较低的细胞毒性 并且 MSN LP 和 ANG MSN LP 对 HBMEC 和 C6 的细胞毒性更低 表明脂 质层可以在一定程度上降低 MSN 的毒性 而引起 MSN 毒性的原因 一方面是由于其巨大的比表面积 与细胞接触时破坏细胞膜的稳定 18 另一方面可能 由于制备时模板剂 CTAB 未能除尽而引起细胞毒 性 19 所以改良的经典 Stober 法还需要进一步改进 本实验所改进的溶液吸附法即反复饱和溶液吸 附法是一种有效提高载药量的方法 与其他载药方 法如浸渍法 共轭结合法 酸碱吸附法 13 20 21 等相比 较 反复饱和溶液吸附法操作方式较为简单 重现性 好 无需贵重仪器设备 最重要的是随着吸附次数的 增加 可以显著的提高药物的载药量 有效解决纳米 载体载药量低的问题 但是采用反复饱和溶液吸附 法耗费时间较长 也只能局限于具有特定刚性结构 的纳米载体如 MSN 碳纳米管 纳米金属等 同时随 着吸附次数的增加 载体材料也有一定的损失 本实验建立的 HBMEC 和 C6 双细胞模型是考 察递药载体跨 BBB 后抗肿瘤作用的模型 非常适合 研究体外递药载体对脑胶质瘤一类肿瘤的抑制作 用 与单纯考察递药载体跨 BBB 模型相比较 11 12 本实验建立的 HBMEC 和 C6 双细胞模型 不仅考察 了递药载体跨 BBB 的能力 而且还能考察递药载体 跨 BBB 模型后对 C6 细胞的抗肿瘤活性 较为逼真 的模拟递药载体在体内的传递过程 同时可以间接 评价递药载体跨 BBB 模型过程中 表面修饰的配体 或脂质层的脱落情况 具有独特的优势 实验中 跨 BBB 模型后 ANG MSN LP PTX 使 C6 细胞处于 G2 187 中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9 图 10PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 对 C6 细胞周期的影响 n 6 珋 x s A 直接作用于 C6 细胞 B 跨 BBB 模型后作用于 C6 细胞 Fig 10Effects of different treatments on the cell cycle of C6 cells after incubation for 48 hc A C6 cells cycle perturbations induced by PTX formulations in culture medium directly B C6 cells cycle perturbations induced by PTX formulations after transporting across the HBMEC BBB model 表 2PTX MSN PTX MSN LP PTX 和 ANG MSN LP PTX 对 C6 细胞作用 48 h 后 G 2 M 期细胞数比率 n 6 珋 x s Tab 2Effect of different treatments on the G2 M phase in cell cycle on C6 cells directly or indirectly for 48 h n 6 珋x s PhaseControlPTXMSN PTXMSN LP PTXANG MSN LP PTX G2 M phase Cell cycle assay 6 93 2 4554 21 6 2144 84 6 0648 30 6 8652 56 6 32 G2 M phase Transwell assay 4 23 1 6712 31 6 2812 47 3 3827 07 5 571 40 92 6 202 注 与 PTX 相比 1 P 0 05 2 P 0 01 Note Compared with PTX 1 P 0 05 2 P 0 01 287 Chin Pharm J 2015 May Vol 50 No 9中国药学杂志 2015 年 5 月第 50 卷第 9 期 M 期的细胞数是 MSN PTX 的 3 2 倍 图 10 B 和表 2 与跨 BBB 转运的结果相似 图 9 表明包裹在 ANG MSN LP PTX 表面的脂质层和修饰的 Angio pep 2 均没有明显脱落 进而可以发挥 Angiopep 2 对 脑胶质瘤细胞的二级靶向功能 本实验表明 Angiopep 2 修饰的核 壳结构介孔 二氧化硅脂质囊纳米粒是一种优良的递药载体 具 有良好的生物相容性和跨血脑屏障的能力 其载入 紫杉醇后对 C6 脑胶质瘤细胞具有较高的抑制效 果 有望应用于脑胶质瘤的治疗 目前该递药载体 的评价 虽然局限在细胞水平 但其在荷瘤大鼠体内 的抗肿瘤作用也得到初步验证 同时 其体内生物 安全性及脑靶向机制尚需进一步研究 致谢 感谢浙江大学化学系陈芳研究员在介孔二氧化硅制备 与表征中给予的帮助 感谢浙江中医药大学药理研究所赵 华军教授在细胞相关实验中给予的技术指导 EFE ENCES 1 ALLA D E PASSI ANI C BENOIT J P Convection enhanced delivery of nanoparticles for the treatment for brain tumors J Biomaterials 2009 30 12 2302 2318 2 OST OM Q T BAUCHET L DAVIS F G et al The epidemi ology of glioma in adults A state of the science review J Neuro Oncol 2014 16 17 896 913 3 GAN C W FENG S S Transferrin conjugated nanoparticles of poly lactide D alpha tocopheryl polyethylene glycol succinate diblock copolymer for targeted drug delivery across the blood brain barrier J Biomaterials 2010 31 30 7748 7757 4 HUANG Q MA H J GUO Y B et al Angiopep Conjugated Nanoparticles for Targeted Long Term Gene Therapy of Parkinson s disease J Pharm es 2013 30 10 2549 2559 5 DEMEULE M GINA A CH C et al Identification and de sign of peptides as a new drug delivery system for the brain J J Pharmacol Exp Ther 2008 324 3 1064 1072 6 EN J SHEN S WANG D et al The targeted delivery of anti cancer drugs to brain glioma by PEGylated oxidized multi walled carbon nanotubes modified with angiopep 2 J Biomaterials 2012 33 11 3324 3333 7 NIU D C LIU Z J LI Y S et al Monodispersed and