第三章 蛋白质化学.doc

第三章 蛋白质化学3.1、蛋白质的重要性和一般组成蛋白质：蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。3.1.1 蛋白质的生物学重要性1.生物体的组成成分（结构蛋白）2.催化（酶蛋白） 3.运输 4.运动 5.抗体免疫(球蛋白) 6.干扰素 7.遗传信息的控制 8.细胞膜的通透性 9.高等动物的记忆、识别机构3.1.2 蛋白质的化学组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳50 氢 7 氧23 氮16% 硫03 其他微 量N的含量平均为16%凯氏（Kjadehl） 定氮法的理论基础。蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故： 蛋白质含量=氮的量100/16=氮的量6.253.2 氨基酸组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。氨基酸的结构特点：n (1). 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸n (2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。3.2.2 氨基酸的分类蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：不参与蛋白质组成，在生物体内呈游离或结合态的氨基酸。 p74常见蛋白质氨基酸的分类根据侧链基团的结构将20中常见氨基酸分为3大类A、 脂肪族氨基酸：中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸)（5种）含羟基氨基酸 (2种) 含硫氨基酸（2种）（一氨基二羧基氨基酸）及其酰胺 （4种）碱性氨基酸（二氨基一羧基氨基酸 ）（2种）B、芳香族氨基酸: Phe， Tyr，TrpC、杂环族氨基酸: His， Pro中性氨基酸：甘氨酸（Gly,G）、丙氨酸（Ala, A）、缬氨酸（Val, V）、亮氨酸（Leu, L） 异亮氨酸（Ile, I）（异亮氨酸含有两个手性碳）含羟基氨基酸：丝氨酸（Ser, S）、苏氨酸（Thr, T）（苏氨酸含有2个手性碳原子）含硫氨基酸：半胱氨酸（Cys, C）、甲硫氨酸（Met, M）（体内代谢甲基的供体）酸性氨基酸及其酰胺： 碱性氨基酸：芳香族氨基酸：杂环族氨基酸：根据R-基团的极性，将氨基酸分为两类：A、非极性氨基酸：Ala（丙氨酸）、Val（缬氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Phe （苯丙氨酸）、Trp（色氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Pro（脯氨酸）（8个）B、极性氨基酸：根据pH7时是否带电极性不带电荷：Ser（丝氨酸）、Thr（苏氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Asn（天冬酰胺） Gln（谷氨酰胺）、Cys（半胱氨酸）Gly（甘氨酸）（7种）极性带正电荷: Lys（赖氨酸）、Arg（精氨酸）、His（组氨酸）(3种)极性带负电荷：Asp（天冬氨酸）、Glu（谷氨酸）（2种）His经常参与酶的活性中心的构成,它是唯一一个R基(咪唑基)的pKa值在7附近的AA.特殊情况：半胱氨酸常以胱氨酸的形式存在。据营养学分类：必需 非必需人体必需氨基酸有八种： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “假 设 来 写 一 两 本 书”3.2.3 氨基酸的理化性质(一)氨基酸的一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异(1) 溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4) 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5) 光吸收：n 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。n 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。Tyr、Trp、Phe在近紫外光区的最大吸收峰（max）和摩尔消光系数（p77）v 酪氨酸的lmax275nm，e275=1.4x103 ;v 苯丙氨酸的lmax257nm，e257=2.0x102;v 色氨酸的lmax280nm，e280=5.6x103;（二）氨基酸的离解性质n 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。n 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。如果在某一pH 值下，氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等，即净电荷为零，则称该 pH 值为该氨基酸的等电点 (pI)。n 各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的pI在微酸性；碱性氨基酸的pI在碱性pH范围；酸性氨基酸的pI在酸性pH范围。n 氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。pH pI, 样品带负电荷，样品点向阳极移动pH = pI, 样品不带电荷，样品点不移动氨基酸等电点的确定：1）中性氨基酸n 等电点（pI）的高低与氨基酸分子两性解离基团的解离平衡常数有一定关系。用K1、K2分别表示-COOH和-NH3+表观解离平衡常数时，它们的负对数分别用pK1、pK2表示，则中性氨基酸的等电点在数值上等于两个pK值之和的二分之一。即： pI = (pK1 + pK2) / 2（2）酸、碱性氨基酸在溶液中氨基酸随pH升高而逐级解离时，总是pK值小的基团先解离，pK值大者后解离。因此，对于具有三个解离基团的氨基酸，只有靠近等电离子的两个pK值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写出解离反应式，皆可根据等电离子两边的pK计算其pI值。酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 （三）氨基酸的重要化学反应1.与亚硝酸反应2.与甲醛反应3.脱羧反应4.成盐反应氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。5. 成肽反应一个氨基酸的 氨基和另一个氨基酸 羧基脱水缩合，生成的酰胺叫做肽，这种酰胺键叫做肽键。6.茚三酮反应（鉴别反应）在450nm处有最大吸收率，在0.550 g / ml范围内，氨基酸含量与光密度成正比。7.羰氨反应： 氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素”。食品加工中将这种反应称为褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅影响原料利用率，而且有毒副作用。8.个别R基团的反应（略）3.2.6 氨基酸分析层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个是固定相，另一个是流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的方法。层析技术的三个基本构成条件v 水不溶性惰性支持物。v 流动相（能携带溶质沿支持物流动）。v 固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用）。层析技术的应用对于分子大小不等的化合物，例如含多种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的化食物，常用吸附层析法分离；对于既溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用分配层析分离；电解质混合物则宜用离子交换层析分离。分配层析技术分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。包括纸上层析、薄层层析、气相层析。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的浓度比值。在层析条件确定后，分配系数是一个常数。以K表示。分配层析的基本原理分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可以沿固定相流动，即流动相。溶质在流动相的带动下流经固定相时，溶质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系数不同而分离。纸上层析是以滤纸为支持物的一种分配层析。滤纸能吸收2225的水，其中67的水以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所以纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相的层析技术。由于各物质的分配系数不同，移动的速率也就不同，从而达到分离的目的。3.2.4 氨基酸的制备和用途3.3 肽n 3.3.1 肽的结构n 肽：氨基酸通过肽键相连形成化合物称为肽。n 肽键：由一个氨基酸的 -羧基与另一个氨基酸的 -氨基脱水缩合形成的酰胺键，称为肽键。n 肽链：氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。n aa残基：肽链中的aa因脱水、缩合而稍有不全。n 肽链主链骨架：在肽链中除去 碳上的R基和H外，剩下的部分为肽链主链骨架。n 侧链基团：氨基酸残基中与-碳相连的R基团n 肽链的方向性：左边：N-端（氨基末端）；右边：C-端（羧基末端） n 肽链书写方式：N端C端n 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。命名：根据氨基酸组成，由N端C端命名3.3.2 肽的理化性质n 1）每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。n 2）在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端a-NH2和游离末端a-COOH以及侧链上可解离的基团。n 3）每一种肽都有其相应的等电点4）颜色反应A、双缩脲反应:双缩脲是两分子尿素经过加热失去一分子的NH3而得到的产物。双缩脲与碱性硫酸铜作用生成蓝色的铜-双缩脲络合物,称为双缩脲反应. 含有2个以上肽键的多肽,也能发生双缩脲反应,生成紫红色或蓝紫色络合物,应用于多肽链的定量测定.B、C、茚三酮反应3.3.3 天然存在的活性肽n 活性肽:以游离状态存在于生物体内的具有特殊生理功能的分子质量比较小的多肽.n 肌肽和鹅肌肽：二肽；抗氧化作用n 谷胱甘肽(GSH)：三肽；参与细胞氧化还原反应n 脑啡肽：五肽；镇痛作用n 催产素和加压素：九肽n 促肾上腺皮质激素：39肽，刺激肾上腺皮质的发育和分泌n 多肽抗生素：抗细菌n -鹅膏蕈碱：8肽，抑制真核生物RNA聚合酶II的活性，使RNA的合成不能进行。谷胱甘肽（GSH）：n 全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。 谷胱甘肽的生理功用：n 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；n 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；n 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；n 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。3.4 蛋白质的分类n 1）化学结构：完全由氨基酸构成简单蛋白、含有非蛋白部分结合蛋白n 2）蛋白质的形状：球状蛋白、纤维状蛋白n 3）生物功能：活性蛋白/非活性蛋白；酶，运输蛋白，营养和储存蛋白，收缩蛋白或运动蛋白，结构蛋白，防御蛋白3.5 蛋白质的结构n 3.5.1 蛋白质的一级结构：是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序和连接方式。n 蛋白质的一级结构包括：组成蛋白质的多肽链数目；多肽链的氨基酸数目、种类和顺序；以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。3.5.2 蛋白质的空间结构n 蛋白质的一级结构不具有功能，只有形成正确的结构才具有功能。n 二级结构以上的结构叫高级结构，由于高级结构是指各原子或基团在空间上的分布，所以又叫空间结构，或三维结构、蛋白质构象。n 构型：一个化合物分子中原子的空间排列，这种排列的改变会引起共价键的形成和破坏，与H键无关。 是小分子化合物具有的结构。n 构象：表示多肽结构中一切原子沿共价键转动而产生的不同空间排列，这种构象的改变会引起H键的形成和破坏，与共价键无关。为多肽等大分子物质具有的结构。多肽链折叠的空间限制n 1.酰胺平面 amideplanen 2.二面角（和）一个 C 原子相连的两个肽平面，由于 N 1 C 和 CC 2 （羧基碳）两个键为单键，肽平面可以分别围绕这两个键旋转，从而构成不同的构象。一个肽平面围绕 N 1 C （氮原子与 碳原子）旋转的角度，用 表示。另一个肽平面围绕 CC 2 （ 碳原子与羧基碳）旋转的角度，用 表示。这两个旋转角度叫二面角。3.5.3 蛋白质的二级结构n 指蛋白质多肽链主链骨架中的若干肽段各自沿着某一个轴盘旋或者折叠，并以H键维系，从而形成的有规则的局部的空间排列方式n 蛋白质的二级结构主要有a-螺旋、b-折叠、b-转角n （1） -螺旋n 肽平面：n -螺旋肽平面n 由于肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为肽平面-蛋白质构象的基本单元n 平面特征：n （1） 肽键具部分双键性质n （2） 肽键的4个原子与2个碳原子组成一个刚性平面-螺旋：肽链主链骨架绕螺轴卷曲上升而形成的一种构象。大多为右手螺旋，是蛋白质最常见的二级结构，在生物体中，肽链合成后自发形成-螺旋结构。1951年由Pauling和Corey提出。（2）其它二级结构n -折叠n -转角n 自由回转或无规卷曲（randon coil) n 蛋白质二级结构的稳定因素: 氢键.-折叠 ： n 多条多肽链或多肽链的一部分与另一部分并排地排列，靠链间或链内AA残基上的CO和另外一个AA残基的N-H形成氢键维系的一种片状结构。n 基本特征：肽链的主链比较伸展，呈锯齿桩折叠构象， a-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上。b-折叠有两种类型：一种为平行式，另一种为反平行式-转角 ： n 指主链发生了一个180度的回折，回折的拐角就叫b转角.n 常有个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。 自由回转或无规卷曲：n 指那些没有明确重复周期结构的“卷曲结构”，它并非是“无规”卷曲，而是有序的非重复结构。n 这些无规卷曲结构常常构成蛋白质的活性结构部位和特异功能部位。3.5.4 蛋白质的超二级结构是指二级结构的基本单位（ -螺旋、 -折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。 超二级结构有三种基本组合形式： -螺旋的聚集体（ ） -螺旋和 -折叠的聚集体（） -折叠的聚集体（ 和C ）蛋白质的结构域1970年Edelman C.为了描述免疫球蛋白（IgG）分子的构象，提出了结构域的概念。在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就称为结构域。特点： A 结构域之间有一段肽链相连铰链区B 各个结构域可以相似或不相同C 结构域一般为酶活性中心3.5.5 蛋白质的三级结构n 指多肽链在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键使a-螺旋、b-折叠、b-转角等二级结构互相配置而形成的特定构象。n 如：鲸肌红蛋白的三级结构特点：n A.从整个分子的三级结构的外形看是球形或者是椭球形，分子紧密。n B.在分子内部形成一个疏水的核，它是大部分非极性基团卷入分子内部形成。n C.分子表面是极性的，形成一个亲水的外壳，这是由于极性基团位于分子表面形成，它们在分子的表面分布不均匀，形成了很多性质不同的小区微环境。n D.在分子表面上有一条深陷的裂隙，其中分布的基团不同。3.5.6 蛋白质的四级结构n 蛋白质的四级结构：由2条或2条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成的特定构象的蛋白分子称为蛋白质的四级结构。n 特点：n A.构成蛋白质分子四级结构的单位称为亚单位或亚基。n B.亚基之间以非共价键相连接。n C.具有实际结构的蛋白质分子只有构成四级结构以后生物学功能才完整亚基n 构成蛋白质的多肽链，每条肽链都具有独立的三级结构，且都以非共价键相连，我们把这样的每条肽链叫做一个亚基或亚单位。n 每个亚基一般由一条多肽链构成，有时也可由两条多肽链构成，如肽链间通过-S-S-相连成为一个亚基。3.5.7 蛋白质分子中的重要化学键n 1.共价键：肽键、二硫键等。主要是形成蛋白质一级结构。n 2.次级键：H键、盐键、疏水键、范德华力等。主要用于维持蛋白质空间结构的稳定性。3.6 蛋白质的重要性质n 3.6.1 胶体性质n 1.蛋白质分子的直径在胶体的范围内；n 2.蛋白质胶体溶液稳定的因素： n （1）直径1-100nm; n （2）溶剂化层n （3）表面带有同种电荷 n 3.蛋白质胶体性质：n （1）布朗运动n （2）丁达尔效应n （3）不能透过半透膜 （透析）n （4）电泳 3.6.2 蛋白质的两性解离及等电点n 1. 蛋白中的解离基团 n AA是两性解离物质，蛋白质是由各种AA组成的高分子，其AA残基上的侧链基团在一定的pH条件下可以进行酸式解离或碱式解离，使蛋白质带电。 2. 等电点：在某一pH时，它所带的正负电荷数相等，即净电荷为0，在电场中既不会向阳极移动，也不会向阴极移动，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点，用pI表示。电泳n 在电场中，如果蛋白质分子所带正电荷多于负电荷，净电荷为正，则向负电极移动，反之，净电荷为负，向正极移动，这种泳动现象称电泳。n 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。n 利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。3.6.3 变性与凝固n 3.6.3.1 变性作用n 当天然蛋白质受到某些物理或化学的因素影响，使其分子内部原有的空间结构发生变化时，理化性质改变，生物活性丧失，并未导致蛋白质一级结构的变化，这种过程称为蛋白质的变性作用。n 变性后的蛋白质叫变性蛋白质，通常都是以固体状态存在，不溶于水和其它溶剂。n 变性的可逆性复性：如果引起蛋白质变性的因素较为温和，蛋白质的空间结构仅有轻微局部改变，当除去变性因素后，蛋白质的空间结构恢复到接近原来的状态，其理化性质、生物活性也恢复，这个过程称为复性。n 1.变性因素：热、紫外光、强酸（碱）、剧烈搅拌、重金属、生物碱等n 2.变性蛋白的几个特点：n A 蛋白质变性后丧失生物活性。n B 变性蛋白质溶解度显著降低，不溶于水，易形成沉淀析出，溶于酸碱中。n C 肽链松散，反应基团如-SH、-S-S-、酚羟基等数目增多。n D 变性蛋白易被蛋白酶水解。3.6.3.2 凝固作用 p1263.6.4 别构作用n 含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象性质和功能发生改变的作用。n 例如：血红蛋白的别构现象3.6.5 沉淀作用n 蛋白质分子从溶液中离析出来叫做沉淀反应。n 要使蛋白质沉淀可用两种方法：中和电荷和破坏水化层。1.可逆沉淀n 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，这种沉淀又叫非变性沉淀。可逆沉淀是分离纯化蛋白质的基本方法，如pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法。2.不可逆沉淀n 在强烈沉淀的条件下，不仅破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能重新溶解于水。n 由于沉淀过程发生了蛋白质结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。n 如加热、强酸（碱）、重金属、生物碱沉淀等等。3.6.8 蛋白质的颜色反应3.7 蛋白质结构与功能的关系3.7.1 蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础 （二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。3.7.2 蛋白质空间结构与功能的关系 （一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 （二）血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。协同效应：一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应；如果是抑制作用则称为负协同效应。血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应：蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。3.8 蛋白质的分离纯化和鉴定n 纯化的实质：n 增加制品(preparation)的纯度或比活性n 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存分离纯化蛋白质的主要方法n 根据蛋白质的溶解度分离n 根据电荷差异分离n 根据分子大小分离n 根据配体特性异性分离（亲和层析）n 选择性吸附分离（物理吸附）n 根据疏水性的差异 蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析n 总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法n 特定蛋白组分的含量分析：n 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）n 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)根据分子组成测定最小分子量如肌红蛋白含0.335%的铁 Fe分子量 55.8最小M Fe(%) = 0.335 =16700 (实为16900马心)牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp重点复习：n 1.氨基酸种类、结构特征、性质；n 2.蛋白质结构、结构与功能的关系；n 3.等电点理论及其应用；n 4.蛋白质变性理论及其应用；n 5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基本原理。n 6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。第六章 维生素化学定义：维生素(vitamin)是机体维持正常功能所必需，但在体内不能合成或合成量很少，必须由食物供给的一组低分子量有机物质。分类: 脂溶性维生素(lipid-soluble vitamin)：VA 、 VD、 VE、 VK水溶性维生素(water-soluble vitamin)：VB族、VC功能： 水溶性V辅酶，参与酶催化反应中底物基团的转移脂溶性V调控某些生物机能 6.2 脂溶性维生素共同特点：均为非极性疏水的异戊二烯衍生物不溶于水，溶于脂类及脂肪溶剂在食物中与脂类共存，并随脂类一同吸收吸收的脂溶性维生素在血液与脂蛋白及某些特殊结合蛋白特异结合而运输 种类：VitA, VitD, VitE, VitK 6.2.1 维生素A（抗干眼病维生素）（1）化学本质与性质不饱和一元醇，脂类中萜类衍生物（2）来源： 动物性食物，植物性食物只含有VA原； A1，主要存在于咸水鱼的肝脏； A2，主要存在于淡水鱼肝脏。缺乏症：夜盲症，干眼病，皮肤干燥等 6.2.2 维生素D（抗软骨病维生素）（1）化学本质和性质：固醇衍生物种类：VitD2（麦角钙化醇）VitD3（胆钙化醇）VitD2原：麦角固醇VitD3原：7-脱氢胆固醇 麦角固醇VitD2 胆固醇7-脱氢胆固醇VitD3VitD3的活性形式： 1, 25- (OH)2-VitD3（2）生化作用及缺乏症1 促进Ca2+在骨骼中沉积缺乏症：儿童佝偻病、成人软骨病2 帮助吸收VA烟雾会遮断制造VD的太阳光； 强烈日晒灼伤后，皮肤停止制造VD。6.2.3 维生素E功能：影响生殖；抗氧化养颜，保护生物膜；促进血红素合成缺乏：死胎、细胞异型植物性食物中含量丰富很少缺乏6.2.4维生素K（凝血维生素）（1）化学本质及性质：一类能促进血液凝固的萘醌衍生物。天然形式：K1（绿叶）、K2（肠道）人工合成：K3、K4（2）生化作用及缺乏症功能：促进凝血 缺乏表现: 易出血 来源：各种食物、肠道中微生物的合成，不易缺乏6.3 水溶性维生素共同特点：易溶于水，故易随尿液排出。体内不易储存，必须经常从食物中摄取。种类：B族维生素和维生素C 6.3.1.1 维生素B1（1）化学本质及性质 存在形式：TPP（硫胺素焦磷酸）（2）生化作用及缺乏症生化作用：缺乏病：脚气病，消化不良（抑制胆碱酯酶）多存在于种皮、瘦肉、白菜中VB1在酸性溶液中稳定，耐热，在pH3.5以下，120不被破坏。 6.3.1.2 维生素B21）化学本质及性质维生素B2又名核黄素存在形式：黄素单核苷酸（FMN） 黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）生化作用及缺乏症：生化作用：FMN及FAD是体内氧化还原酶的辅基，主要起氢传递体的作用。缺乏症：口角炎，唇炎，阴囊炎等。来源：在蛋、奶、肝、牛肉及叶菜中的幼嫩组织含量丰富。6.3.1.3泛酸（VB3），又名遍多酸存在方式：辅酶A（CoASH）化学结构：泛解酸、丙氨酸功能酰基转移酶辅酶，传递酰基；在脂类与糖类代谢中起重要的作用广泛存在，蜂王浆中含量最多。辅酶A广泛被作各种疾病的重要辅助药物。6.3.1.4 VPP（烟酰胺/尼克酰胺）存在方式: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I） NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （辅酶）NADP+生化作用及缺乏症：NAD+及NADP+是体内多种脱氢酶（如苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶）的辅酶，起传递氢的作用。缺乏症：癞皮病来源：在鱼、肉、谷物种皮、蔬菜等食品中含量较多。6.3.1.5 维生素B6 又称吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺功能：作为辅酶参加多种代谢反应，包括脱羧、转氨、氨基酸内消旋、Trp代谢、含硫氨基酸的脱硫、羟基氨基酸的代谢和氨基酸的脱水等。分布广泛,食物中富含，肠道细菌可以合成供人体需要。存在方式:磷酸吡哆醛PLP、PMP6.3.1.5 生物素（VB7 ）为含硫维生素，其结构可视为由尿素与硫戊烷环结合而成，并有一个C5酸枝链。生物素是细长针状的晶体，熔点232，耐热和酸碱，微溶于水。功能：生物素是多种羧化酶的辅酶，在CO2固定反应中起重要作用。分布: 广泛,不易发生缺乏.6.3.1.6 VB11（叶酸造血维生素） 叶酸(folic acid)又称蝶酰谷氨酸体内活性形式为四氢叶酸(FH4) 存在形式四氢叶酸（辅酶F、CoF）功能：一碳单位脱除酶的辅酶，传递一碳基团 含一个碳原子的基团 叶酸参与嘌呤、嘧啶的合成，间接影响蛋白质合成。 磺胺类药物可竞争性地抑制细菌叶酸的合成，导致繁殖中断。缺乏症：巨幼红细胞贫血6.3.1.8 维生素B12（1）化学本质及性质维生素B12又称钴胺素(coholamine)，体内活性形式：甲基钴胺素、5 -脱氧腺苷钴胺素功能：1.促进某些化合物的异构作用。2. 促进甲基转移作用。3. 维持SH的还原型状态。4. 促进核酸和蛋白质的生物合成。5. 维持造血机构的正常运转。6. 促进上皮组织细胞的新生。缺乏症：1. 儿童及幼龄动物发育不良。2. 消化道上皮组织细胞失常。3. 造血器官功能失常，导致恶性贫血。4. 髓磷脂的生物合成减少，损害神经系统。6.3.1.9 VC（抗坏血酸）只能通过食物获取功能：1. 抗坏血病（保护细胞膜）；2. 氢传递体；3.脯氨酸羟基化酶的辅酶；4.酶的激活剂缺乏与补充：坏血病，毛细管脆弱，易碎，表现为牙龈发炎出血，皮肤出现小血斑。倦怠虚弱，关节疼痛十、硫辛酸硫辛酸是少数不属于维生素的辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式：即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）。在机体内起着酰基载体和氢载体的作用。十一、辅酶Q 辅酶Q又称为泛醌，广泛存在与动物和细菌的线粒体中。 辅酶Q的活性部分是它的醌环结构，主要功能是作为线粒体呼吸链氧化-还原酶的辅酶，在酶与底物分子之间传递电子。主要可溶性维生素和相应辅酶：维生素 辅酶 功能1. B1(硫胺素) TPP -酮酸氧化脱羧2. B2(核黄素 ) FMN、FAD 氢载体3. PP 尼克酸（酰胺） NAD+、NADP+ 氢载体4. 泛酸（遍多酸） CoASH 酰基载体5. B6 吡哆醇（醛、酸） 磷酸吡哆醇（醛） 转氨、脱羧、消旋6. 叶酸 FH4(THFA) 一碳基团载体 7. 维生素 羧化辅酶8. C（抗坏血酸） 氧化还原作用9. 硫辛酸 酰基载体、氢载体10. 10. 10. 10.B12（氰钴氨素） 变位酶辅酶一碳基团载体要求： 1、酶的概念 2、酶的命名与分类 酶的系统命名及分类原则，六大酶类的分类序号。 3、酶的化学结构与作用机理 酶的活化中心结构概念特点及其与催化活性的关系，酶的催化作用机理。 4、影响酶促反应速度的因素 底物浓度对速度的影响特点及米氏方程的含义，酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响特点。 5、调节酶、同工酶、多酶系和诱导酶 6、酶活力的测定与分离提纯 7、维生素和辅酶 维生素的概念分类及名称，几种重要的维生素其相应的辅酶的结构特点、生理功能。 九章 新陈代谢总论n 新陈代谢：生物体一方面从环境中摄取食物作为营养物质，另一方面将自身的物质分解成为废物，排泄到环境中去的过程称为新陈代谢或物质代谢。新陈代谢的作用n 1.生物体通过新陈代谢获得它所必需的能量。n 2.通过新陈代谢建造和修复生物体。n 3.通过新陈代谢完成遗传信息的储存、传递和表达，使生物体繁衍生息。新陈代谢的特点n .由多步化学反应组成各反应间有严格的顺序且相互配合。n .在比较温和的条件下进行，绝大多数反应由酶催化。n .新陈代谢作用有高度灵敏的自我调节。n 4.代谢体系在进化中逐步形成，完善，生物间基本相似第十一章 脂质代谢脂肪的分解代谢 脂肪的生物合成脂类代谢主要途径脂类是脂肪和类脂的总称。脂类：脂肪(三酯酰甘油或甘油三酯) (triglyceride,TG)和类脂（胆固醇(cholesterol,Ch)、胆固醇酯(cholesteryl ester,CE)、磷脂(phospholipid,PL)、糖脂(glycolipid,G