用菊芋来制作燃料乙醇 实验方案.doc

用菊芋来制作燃料乙醇1.复合酶在菊芋粉发酵生产燃料乙醇中的应用菊芋的主要成分是多聚果糖，除此之外还含有淀粉、蛋白质、纤维素、半纤维素、果胶质等成分。这些成分可在酶的作用下分解成易于被酵母利用而产生乙醇的物质 。本文研究了采用添加复合酶和耐高温酿酒酵母通过边糖化边发酵的方法生产燃料乙醇的最佳工艺条件。该方法具有操作简单、稳定性好、发酵周期短、生产成本低等优点 ，对进一步实现利用菊芋发酵、规模化生产燃料乙醇具有一定的指导意义。1 材料与方法11 材料111 菊芋 南菊芋1号112 复合 酶自配，组成为：耐高温 阿尔法一淀粉酶：10ug菊芋粉；糖化酶：80ug菊芋 粉；普鲁兰酶 ：40ug菊芋粉 ；纤维素酶酶：16ug 菊芋粉；酸性蛋白酶：10ug菊芋粉；果胶酶：20ug菊芋粉；菊粉酶：25ug菊芋粉 ；B一葡 聚糖酶：10ug菊芋粉 ；B一甘露聚糖酶 ：5ug菊芋粉 ；木聚糖酶：10ug菊芋粉 ；植酸酶：5ug菊芋粉。11_3 耐高温酿酒干酵母12 方法121 菊芋粉成分分析分析指标：水分，总糖，粗脂肪，粗纤维，粗蛋白，还原糖，灰分 。122 干酵母活化称取一定量干酵母于40倍其重量的3540的2的葡萄糖水溶液中。先在37恒温箱中培养1520min然后转移到30恒温箱中培养6070min即可123 残还原糖测定将澄清的蒸馏废液稀释到一定倍数，用DNS法测定 。124 乙醇含量测定采用酒精计法。将发酵液倒入500mL圆底烧瓶中，加100mL水混匀后常压蒸馏 用 100ml容量瓶收集馏出液至刻度，用酒精比重计测馏出液中的酒精浓度和温度，最后换算为 20酒精度 。125 实验计 算酒精产率=酒精产量/原料总量 *100%126 工艺 流程称取25g过4目的菊芋粉于500ml三角瓶中一加入一定量溶有10ug菊芋粉的耐高温阿尔法一淀粉酶的60左右的自来水一于 100加热蒸煮30min一冷却至 35左右加入一定量复合酶和酵母活化液一称重，放于一定温度的恒温箱中一 每隔8h称重1次，直 到发酵结束一蒸馏一测酒精度一测蒸馏废液中残还原糖含量一计算酒精产率 。2. 菊芋生料联合生物加工发酵生产燃料 乙醇1 材料与方法11 材料111 菌种：马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）酵母112 菊芋粉。南菊芋1号，鲜菊芋块茎经洗净、切片、晾晒、烘干、粉碎过筛(相同的料水比下，干粉粒度越小，料液黏度越低，流动性越好，但考虑到工艺成本，采用 60目为宜)得菊芋干粉。菊芋干粉总糖含量65左右。113 辅助酶制剂。AccelleraseXY，木聚糖酶，酶活 20003000ABXUml，最佳 pH4.570、温度 5070。Accellerase1500，纤维素酶，酶组分为纤维素酶(2200CMCUg)和B一葡萄糖苷酶(525Ug)，最佳 pH为 457O、温度为 5070。酒精复合酶，酶活构成：B一葡聚糖酶 136万 Uml，纤维素酶 11万 Um1，半纤维素酶120万Urnl，果胶酶0.3万 IJm1，蛋白酶 15万 Uml。复合酶用量为原料干重的008 010。使用条件为 pH4055、温度 2555，最佳使用条件为 pH48、温度 50。12 方 法121 种子液的培养。菌种分泌的菊粉酶是诱导酶，因此种子培养基添加菊粉。种子培养基配方为菊粉4，蛋白胨2 ，酵母粉1，pH自然，30，接种后在 30、转速 150rmin条件下培养 24h，其 OD达到 10左右，on4.749。122 乙醇发酵。称取60目过筛的菊芋干粉 ，用一定量的自来水拌料，调 pH，接种 10种子液 ，达到一定的初始干粉浓度(包括种子液的体积)，发酵在 500ml三角瓶中进行 ，装液量为40 45，厌氧塞封口，放到 30、150rmin摇床中培养。可以在发酵 12或24h内补菊芋干粉，使其达到一定的菊芋干粉浓度。每 12h取样分析，测还原糖、总糖、乙醇等参数。123 分析方法。1231 总糖和还原糖含量。还原糖的检测采用 3，5一二硝基水杨酸(DNS)法 ，用果糖作标样绘制 DNS显色的标准曲线 。总糖使用 02molL硫酸水解 1h，用 DNS法测定 。1232 乙醇浓 度。由 Agilent6890气相 色谱仪 内标测定 。1233 酵母浓度。采用比浊法测定，种子液制得菌悬液后，稀释 10倍，用酶标仪在波长640nm下测光密度值 。1234 黏度。醪液黏度 由 NDJ一1旋转式黏度计(上海精科天平仪器厂)在 3O条件下进行测定。3. 自絮凝颗粒酵母发酵菊芋汁生产乙醇2.2材料与仪器2.2.1菌种自絮凝颗粒酵母是粟酒裂殖酵母变异株和酿酒酵母变异株通过原生质体融合技术选育得到的融合株，具有良好自絮凝特性和优良的乙醇发酵性能。2.2.2主要原材料新鲜菊芋汁以及菊粉酶2.2.3培养基(l)菌种保藏培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白脉20，酵母粉10，琼脂20;(2)摇瓶种子培养基(g/L):葡萄糖30，酵母粉40，蛋白胨40，121摄氏度下灭菌 20min，供自絮凝颗粒酵母种子扩大培养使用(3)摇瓶发酵培养基:同步糖化发酵用培养基直接由新鲜菊芋汁配制;先糖化后发酵用培养基是将新鲜菊芋汁在 250mL摇瓶中经菊粉酶在60下糖化得到。(4)连续发酵培养基:将发酵用菊芋汁真空减压浓缩到 220g/L左右，灭菌后供自絮凝酵母连续发酵使用。23实验方法2.3.1种子培养方法(l)取新鲜自絮凝酿酒酵母斜面接入装有100ml生长培养基的250mL摇瓶中，在旋转式摇床上，150rpm、30的条件下培养至对数期。(2)取 0.2mL克鲁维酵母(甘油保存)接种种子培养基后，在33， 150rpm条件下培养12h;然后取 1mL接种于种子培养基中，在33，150rpm条件下培养。2.3.2菊芋汁的酶糖化将菊粉酶液经0.22 um膜过滤除菌后按一定的百分比添加到装有100mL菊芋汁的锥形瓶中，然后置于60水浴摇床内进行糖化。菊芋汁初始自然pH为4.6左右，可以满足菊粉酶糖化要求，每隔 50min取样测定菊芋汁中还原糖和葡萄糖浓度。2.3.3自絮凝酵母种子培养及接种自絮凝酵母种子培养24h后，用 0.1mol/L的柠檬酸钠解絮凝，以保证接种量可控，然后按10%的接种量接入发酵培养基中进行发酵，接种到培养基中后柠檬酸钠被稀释，解离的酵母可以重新絮凝。2.3.4菊芋汁批式发酵菊芋汁批式发酵在 250mL摇瓶中进行，发酵温度30摄氏度，自然pH值(4.6左右)，摇瓶转速 160rpm，使用厌氧塞封口，分别采用sHF和ssF技术路线。采用sHF技术路线时，先使用菊粉酶完全糖化菊芋汁，进行灭菌灭酶处理后，接种自絮凝颗粒酵母，进行乙醇发酵。而对于SSF技术路线，菊芋汁中加入菊粉酶后随即接种自絮颗粒凝酵母，进行乙醇发酵，菊粉的水解糖化与酵母的乙醇发酵同步进行。为了便于技术经济分析，SHF和sSF过程菊粉酶的添加量相同。由于SSF工艺中菊粉酶糖化菊芋汁得到的糖随即被酵母利用，系统中没有可发酵性糖积累，因此原料菊芋汁可能不需灭菌处理，在实验中分别考察了原料菊芋汁进行灭菌处理后发酵和不灭菌生料直接发酵。2.3.5菊芋汁连续发酵为了提高菊芋汁乙醇发酵技术的水平，有效容积为2L的发酵罐中加入1L新鲜菊芋汁，考察其SSF连续发酵性能。为了防止连续发酵长期运行时的杂菌污染，菊芋汁进行灭菌处理后，接入经摇瓶培养24h后得到的自絮凝酿酒酵母颗粒和7000U的菊粉酶液(经滤膜过滤，发酵罐中的菊粉酶浓度约7U/mL)。发酵罐温度控制在30，pH控制在4.5，转速为 150rpm，残总糖降到20g/L时流加灭菌处理的浓缩菊芋汁，稀释速率为0.02h-1，通气量为0.02L/min。每隔12h测乙醇、还原糖及总糖。利用菊芋生产乙醇的研究2.3.6分析方法(l)葡萄糖的分析采用葡萄糖自动分析仪(SBA一50B生物传感分析仪);取 1mL离心过的发酵液的上清液，稀释一定倍数至葡萄糖浓度小于1g/L，取25 u L稀释液直接进样，读取数值，计算出单位体积发酵液的葡萄糖浓度。(2)还原糖的分析采用DNS显色法，DNS在与还原类物质共热反应后会生成棕红色的氨基化合物，反应条件为沸水浴 5min，迅速取出置于冰水浴中终止反应。在54Onm下，用分光光度计测定吸光度，制作标准曲线来确定还原糖含量72。(3)乙醇浓度利用SBA生物传感分析仪，取 1mL离心过的发酵液的上清液，稀释一定倍数至乙醇浓度小于1g/L，取25 u L稀释液直接进样，读取数值，计算出单位体积发酵液的乙醇浓度。(4)菌体浓度以单位体积发酵液中细胞干重来表示取 3mL菌液，离心去除上清，用去离子水洗涤菌体两次，置85烘箱烘干24h后称重。(5)菊粉酶活的测定方法:将培养液离心分离，上清液作为粗酶液，取适当稀释的酶液5mL，加入2%的菊粉溶液 0.5mL，测定酶活。菊粉酶活性单位定义:反应体系中每min产生1u mol己糖所需酶量为1个酶活单位。4. 粟酒裂殖酵母发酵菊芋生产燃料乙醇试验1材料和方法11材料111菌种粟酒裂殖酵母;酿酒酵母;酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母112菊芋粉(鲜菊芋经洗净、切片、晾晒、干燥、粉碎后置于干燥环境中保存备)和菊粉113培养基(1)斜面培养基。豆芽汁蔗糖琼脂培养基,接种一环菌种于豆芽汁蔗糖琼脂斜面培养基, 30,培养72 h,储于4冰箱备用。(2)种子培养基S.pombe和K.marxianus:菊粉20 g/L,酵母膏15 g/L,蛋白胨20 g/L, pH值4.6;S. cerevisiae:豆芽汁蔗糖培养基。121灭菌20min备用。(3)发酵培养基三角瓶发酵:菊粉(按试验要求配制所需质量浓度, g/L),酵母膏15 g/L,蛋白胨20 g/L,除特别指出外,初始pH值均用稀盐酸调节至4.0, 115灭菌35min。5L发酵罐:菊芋汁、菊芋粉配成的培养基,用稀盐酸调节初始pH值至4.0, 115灭菌35min。12试验方法121种子液的制备酵母接入种子培养基中, 30振荡培养48 h,使细胞浓度达到1108个/mL以上。122S. pombe的乙醇发酵性能每个三角瓶装入100mL、200 g/L菊粉发酵液,分别接入乙醇发酵菌种,接种量5%, 30静止培养,定时称量,记录CO2失重,估计发酵状况。发酵结束后,全部倒入全玻璃蒸馏器进行乙醇蒸馏,测定乙醇含量,对比S.pombe和S. cerevisiae的乙醇发酵性能。5. 稀酸水解菊芋制乙醇技术研究1 实验部分1 1 试剂与仪器菊芋干片，磨碎至 20 40 目备用; 酵母干粉; 葡萄糖、蔗糖、果糖均为生化级; 浓硫酸，尿素等均为分析纯; 无水乙醇，色谱纯。water 2695 色谱仪。1 2 实验方法1 2 1 水解 在 500 mL 三角瓶中加入浓度为 3%的稀硫酸 100 mL，30 g 菊芋粉，80 反应 90 min。离心取上清液测定水解液中的果糖、葡萄糖和二糖浓度。1 2 2 发酵 取 600 g 菊芋粉加入到 2 L 3% 的稀硫酸中，置于5 L 发酵罐中，80恒温搅拌( 100 r/min) 90 min，使菊芋粉中的多糖充分水解成可发酵糖，降温到 32 ，加入 NaOH 中和到pH 5 0，加入 2.6 g 安琪酵母、0.4 g 尿素，发酵。6. 以菊芋为原料利用固定化酶和细胞两步法发酵生产乙醇1材料与方法材料1)菌种 酒精酵母(2)洋姜 新鲜洋姜洗净、切片、晾干3)菊粉酶制剂 菊粉酶方法1还原糖测定 费林试剂法2乙醇的测定1)比色法测定乙醇含量酒精与重铬酸钾在酸性条件下发生氧化还原反应,酒精被氧化成乙酸,而六价铬被还原成三价铬,由此所形成的颜色变化与酒精的浓度成正比,在分光光度计610 nm的波长下比色,通过标准曲线测得酒精浓度.取发酵液1 mL ,放入蒸馏瓶中,加入适量水,蒸馏15 mL ,定容至50 mL ,取出1 mL与重铬酸钾反应,测出乙醇的含量.2)比重法测定乙醇含量蒸馏方法同1) ,蒸馏液定容100 mL ,用比重计测定3酵母细胞的扩增培养将酵母细胞在2%葡萄糖, 1%蛋白胨, 1%酵母膏液体培养基中28下摇床培养48 h,细胞数达108个/ml4酵母细胞的固定化将108个/mL浓度的酵母细胞悬液加入到10%聚