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ELISA Enzymeslinkedimmunosorbentassay 2020 1 28 目录 ELISA原理 ELISA简介 ELISA实验步骤 ELISA相关仪器 试剂 ELISA简介 酶联免疫吸附试验 Enzyme LinkedImmunosorbnentAssay 简称ELISA 它是实验室最常用的检测方法 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质 其催化效力超过所有人造催化剂 ELISA就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术 使用酶去标记抗原或抗体以后 既不影响抗原抗体反应的特异性 也不改变酶本身的活性 因此ELISA具有准确性高 检测时间短 价格低廉 判断结果有客观标准 结果便于记录和保存等优点 适合于大批标本的检测 广泛应用于食品安全检测 医疗检测以及免疫实验分析等领域 1 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面 并保持器免疫学活性 例如 蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附 2 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物 而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性 3 酶结合物与相应抗原或抗体结合后 可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的 由此进行定性或定量分析 ELISA基本原理 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件 可设计出各种不同类型的检测方法 主要类型有双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法等 ELISA类别 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 先将已知抗体连接在固相载体上 待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合 形成抗体 待测抗原 酶标二抗的复合物 复合物的形成量与待测抗体原成正比 双抗体夹心法 当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点 因此不能用双抗体夹心法进行测定 可以采用竞争法模式 竞争法 双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物 以检测相应的抗体 与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体 双抗原夹心法 间接法是检测抗体常用的方法 其原理为利用酶标记的抗抗体 抗人免疫球蛋白抗体 以检测与固相抗原结合的受检抗体 故称为间接法 间接法 除了以上常见的4种检测方法外 还有直接法 捕获包被法 竞争法 测抗体 双抗原夹心法 ABS ELISA法等其他方法 ELISA实验过程主要分以下三步 第一 实验设计1 了解将要测定的样品属于什么类别 选用最佳的ELISA检测方法 2 选用正确的阴性对照品 阳性对照品 样品标准品等 3 规划实验中所使用各种试剂的浓度 加入量 反应时间等 4 再细化实验中每个步骤的开展时间 合理的时间安排能使实验有条不絮的进行 第二 实验准备1 实验所使用物料的清点 2 实验试剂的配备 3 实验仪器的预约 第三 实验操作 以双抗体夹心法为例 1 包被 在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体 使之与板结合 4 过夜 大于12小时 或37 孵育2小时 包被后洗涤一次 2 封闭 一般使用0 1 2 BSA 5 脱脂奶粉 1 明胶 10 小牛血清等 37 反应2小时 封闭液体积要大于包被液体积 封闭后清洗3次 3 加入含有待测抗原的样品 37 孵育1小时 4 洗涤 清洗3次 5 加入酶标液 酶标二抗 37 孵育1小时 6 洗涤 清洗5次 7 加入酶促反应底物 发生显色反应 37 避光显色5 15min 终止显色后测量450 630nm吸光值 注 上面实验共12次清洗 清洗次数可适当增多 同一反应尽量保证使用同一种清洗液 常见清洗液有PBST TBST PBS等 结果判定 定性测定定性测定的结果判断作出 有 或 无 的回答 分别用 阳性 阴性 表示 在这种半定量测定中 将标本作一系列稀释后进行试验 呈阳性反应的最高稀释度即为滴度 根据滴度的高低 可以判断标本反应性的强弱 这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性 弱阳性更具定量意义 在间接法和夹心法ELSIA中 阳性孔呈色深于阴性孔 待测孔 P 与对照孔 N 的比值 P N 大于1 5或2者为阳性 N为阴性对照孔 定量测定 实验中使用的试剂 仪器 常用试剂 1 包被缓冲液 0 05MPH9 6碳酸盐缓冲液 0 1MPH9 6碳酸盐缓冲液 pH7 2的磷酸盐缓冲液及pH7 8的Tris HCL缓冲液等 2 封闭液 0 1 2 BSA 5 脱脂奶粉 1 明胶 10 小牛血清等 一般溶于0 15MPBS中 3 洗涤液 PBS PBST TBST等 4 抗体稀释液 PBST 0 5 2 BSA 溶于PBST中 等 5 底物缓冲液 TMB显色液 OPD显色液 ABTS显色液 AP显色液等 根据所使用的酶标抗体选用对应的底物缓冲液显色 6 终止液 2M硫酸 常见仪器 单孔道 多孔道移液器 振荡器 洗板机 酶标仪 计时器 实验中遇到常见问题与解决方法 1 阴性对照出现阳性结果 造成该现象的原因有4个 1 试剂或样品可能被污染 或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染 应当更换使用试剂 小心操作 2 酶标板洗板不彻底 尝试用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤 洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净 3 抗体量过多导致非特异结合 应该根据推荐用量使用抗体 尽量使用较少的抗体 4 夹心法 捕获法中检测抗体与包被抗体 抗原反应 确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体 两者之间不会互相反应 2 酶标板整体背景高造成该现象的原因有4个 1 抗体非特异性结合 应确保进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液 最好使用5 10 的与二抗同种动物来源的血清或牛血清 确保板孔经过预处理以防止非特异结合 使用亲和力强 纯度高的抗体 最好经过了预吸收处理 2 底物结合浓度过高或反应时间过长 应调整底物的浓度 当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应 适当缩短显色时间 3 底物溶液不新鲜或被污染 应检测底物溶液 正常的底物溶液应该是清亮透明的 如果变黄或其他颜色则是被污染的标志 4 底物孵育过程没有避光 底物孵育应该在避光环境下进行 3 吸光度数值偏高或偏低造成的该现象的原因有几个 1 样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低 可尝试增加样品的使用量或者更换一个检测更灵敏的方法 2 加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高 应确定使用的是建议抗体用量 或者为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量 3 孵育时间不够长会导致检测结果偏低 应适当延长抗体或抗原的孵育时间 确保待测样品与检测抗体能充分结合 4 孵育温度不适合 应保证抗体在最适宜并且稳定的温度下孵育 一般是室温 25 孵育2h或37 孵育1h 影响因素的分析 1 标本的影响1 1溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质 红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素 在洗涤过程中往往难以完全洗脱 它可使H2O2释放出原生态氧 O 从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质 即显蓝色 产生假阳性 所以严重溶血标本禁用 1 2标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶 因此 被细菌污染的标本同溶血标本一样 亦可产生非特异性显色而干扰测定结果 1 3标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本 在间接法ELISA测定中会导致本底过深 造成假阳性 为克服上述干扰 ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集 如不能立即测定 5d内测定的血清标本可存放于4 1周后测定的血清标本应低温冻存 冻存后融解的标本 蛋白质局部浓缩 分布不均 应充分混合后再测定 但混匀时应轻柔 不可强烈振荡 1 4塑料试管能吸附抗原物质 样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管 并使用非抗凝标本 肝素抗凝血浆会增加OD值 EDTA 酶抑制剂 如NaN3 可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性 1 5标本凝固不全在工作中 有时为了争取时间快速检测 常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清 使血清中仍残留部分纤维蛋白原 在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块 易造成假阳性结果 因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清 2 试剂影响ELISA检测试剂厂家较多 不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别 使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性 因此 选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之 3 操作技术的影响3 1吸量的准确性 吸量不准确 直接影响检测结果 因此加样器也要经常清洗 定期校准 3 2温浴影响 抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求 酶标板周围与内部孔升降温速率不同 造成周边与内部孔结果差异 干浴与水浴存在明显的差异 尽可能使用水浴 并要求固相板放入水中 减少受热不均 贴密封膜 防止污物浸入 3 3加样次序影响 有时我们在加样过程中 常常会遇到个别标本未离心等情况 为了节约时间 往往这时我们会先加酶结合物 然后等标本分离好后再加标本 这样 竟常常会造成HBeAb和HBcAb的假阴性 因为HBeAb和HBcAb都是竞争抑制法 先加入酶标记的抗体 首先与固相载体上的抗原结合 待加入显色剂后 因酶的存在而显色 故呈阴性 3 4洗涤方法对结果的影响 洗涤是ELISA操作的重要环节 手洗条件一致性较差 对结果影响较大 全自动洗板机使用不当也会影响结果 血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态 造成未结合标记酶洗脱不彻底 导致 花板 造成假阳性或假阴性 所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况 洗板机不用时应用去离子水清洗几遍 4 干扰物质的影响4 1有人认为大约40 的人血清标本中含有非特异性干扰物质 可以不同程度影响检测结果 常见的干扰物质有 类风湿因子 补体 交叉反应物质和其他物质等 如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性 高浓度的AFP 如孕妇 在储存过程中可能形成二聚体会导致本