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碱性成纤维细胞生长因子对癫痫大鼠海马神经元Caspase3表达的影响作者：刘君鹏，迟兆富，雷惠新，汪银洲 作者单位：福州，福建省立医院神经内科 济南，山东大学齐鲁医院神经内科 【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对癫痫大鼠海马神经元的神经保护作用及可能的机制。方法 戊四氮诱发大鼠癫痫发作后，腹腔分别注射生理盐水(B组)和bFGF(C组)，与空白对照组(A组)按一定时段断头取脑，进行HE染色和Caspase3免疫组织化学染色。观察各组大鼠海马神经元的损伤以及Caspase3的表达。结果 HE染色：B组神经元形态散乱，大量神经元凋亡、坏死；C组可见散在的神经元凋亡，变性坏死少见。Caspase3免疫组化染色：B组6 h可见海马CA1、CA3和齿状回门区部分细胞的胞浆和核内有棕黄色沉淀物，24 h阳性细胞数及着色深度达到高峰，持续至72 h，120 h后表达减弱。C组阳性细胞数及染色度与B组有相似的时间依赖性，但总体表达较B组弱，组间各时间点中1272 h的差异均有统计学意义(P0.01),6 h及120 h的差异则无统计学意义(P0.05)。结论 bFGF能显著减轻癫痫所致的大鼠海马神经元损伤。 【关键词】 癫痫；碱性成纤维细胞生长因子；Caspase3；大鼠 The effect of basic fibroblast growth factor on the expression of Caspase3 gene in hippocampal neurons of epileptic rats LIU Junpeng,CHI Zhaofu,LEI Huixin,et al.Department of Neurology,Fujian Provincial Hospital,Fujian,Fuzhou 350001, China 【Abstract】 Objective To investigate the neuronprotective function and the possible mechanism of basic fibroblast growth factor (bFGF) to hippocampal neurons of epileptic rat.Methods Epileptic seizure in rat model was induced by pentylenetetrazol and followed by normal saline(group B) or bFGFabdomeninjection(group C),normal rats without epilepsy were taken as blank control group (group A).HE staining and immunohistochemistry technique were carried out to observe the alteration of neurons and the expressions of Caspase3.Results HE staining:neuronal degeneration was observed in area CA1,CA3 and dentate hilus in both Group B and Group C,while cell degeneration and apoptosis in Group C was less than those in Group B.Caspase3 immunohistochemistry staining showed neuron apoptosis in Group C was less than those in Group B at different time points(P0.01).Conclusion The bFGF could reduce the hippocampal neuronal damage in epileptic rats significantly, which suggested that bFGF could regulate the expression of Caspase3 gene and sequentially protect neurons. 【Key words】 Seizure;Basic fibroblast growth factor;Caspase 3;Rats 癫痫是由多种病因引起的慢性脑部疾患，以脑神经元过度放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征。癫痫脑损伤引起的神经元死亡包括凋亡和坏死两种形式。神经营养因子(NTF)是一类能促进和维持特异性神经元生长、存活和分化，并影响突触可塑性的可溶性多肽因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)就是其中的一类。实验证实，不同方式诱发的癫痫发作都可引起脑内很多区域,包括大脑皮质、海马、齿状回、内嗅皮质、嗅球等bFGF的升高1;同时，外源性bFGF能显著抑制大鼠海马内神经细胞的丢失，对癫痫诱导的长期行为缺陷也有明显改善作用2。本实验应用戊四氮化学点燃的方法诱导癫痫发作,通过Caspase3的表达观察海马各区域神经细胞凋亡情况,并用bFGF进行干预，将其应用后神经细胞凋亡情况与前者进行对比，从而研究bFGF对癫痫所致的海马神经细胞凋亡的影响。 1 材料与方法 1.1 大鼠分组 选用46周龄健康成年雄性Wistar大鼠36只(由山东大学医学院实验动物中心提供)，体质量260330 g，自由进水、进食，室温1825饲养。采用随机数字表法分为3组：空白对照A组(6只)、戊四氮生理盐水(NS)B组(12只)及戊四氮+bFGF C组(18只)。 1.2 实验方法 1.2.1 癫痫模型的建立： 用1.5%戊四氮做致痫剂，以50 mg/kg的剂量对B、C组大鼠进行腹腔注射，数分钟后即出现持续性全身强直阵挛发作。并对A组大鼠腹腔注射等量的生理盐水做对照。 1.2.2 点燃标准： 根据Racine 6级评定标准3：0级：无任何发作迹象；I级：凝视、咀嚼或须动；II级：点头或湿狗样抖动、搔抓；III级：前肢局限性痉挛；IV级：伴有后肢站立的全身强直性发作；V级：伴有站立并摔倒的全身强直阵挛性发作。以IVV级发作持续35 min作为模型制备成功的标准。 1.2.3 bFGF干预： 达到点燃状态后30 min，对C组给予0.5% bFGF 50 g/kg腹腔注射，B组大鼠给予等量NS腹腔注射。以后每天1次注射等量前述液体。 1.2.4 海马组织标本制作观测： 按照6个亚组规定的时间(分别为癫痫发作后6、12、24、48、72 h、120 h)，将B、C组大鼠断头取脑，A组腹腔注射NS后30 min断头取脑。常规制备石蜡标本，行HE染色及Caspase3免疫组织化学染色：标本依次加一抗(兔抗鼠Caspase3)、二抗(生物素标记的羊抗鼠IgG即用型抗体)，DAB显色，4倍显微镜下观察(515 min)，出现棕黄色阳性细胞时终止反应。HE染色：光学显微镜下观察海马CA1、CA3和齿状回门区组织学改变；免疫组化染色结果应用奥林巴斯TJTY400TC真彩色细胞图像分析仪对切片进行图像分析。 1.3 观测指标 (1)平均阳性反应细胞数(N)；(2)阳性反应细胞平均光密度(D)；计算比较各自的表达量。 1.4 统计学方法 应用SPSS 11.5软件。计量数据以s表示，组间数据采用配对方差分析进行多重比较。P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 HE染色 A组大鼠海马CA1、CA3区及齿状回门区神经元排列整齐紧密，边缘清晰，胞浆透明，染色质分布均匀，核仁清晰，形态正常；B组神经元形态散乱，边缘欠清晰，胞质嗜伊红，核固缩浓染，染色质凝集成块，边集；也可见少量神经元变性坏死，HE深染，呈现胞浆和胞核水肿，胞体增大。C组可见散在的神经元凋亡，变性坏死少见。见图1(插页2)。 2.2 免疫组化Caspase3染色 A组各时间点均仅可见海马内有少量散在的Caspase3阳性细胞，着色不深；B、C组均在6h可见海马CA1、CA3和齿状回门区部分细胞的胞浆和核内有棕黄色沉淀物，12 h可见阳性细胞数增多，染色较深，2448 h阳性细胞数及着色深度达到高峰，持续至72120 h后表达减弱。见图2(插页2)。 定量分析显示，B组海马内阳性细胞数及染色度均为最高，而A组中Caspase3的表达始终维持在很低的水平，组间比较各组均有明显差异(P0.01)；各时间点的比较显示，B、C组在6 h和120 h时的差异没有统计学意义(P0.05)，其余各时间点的差异均有统计学意义(P0.01)。见表1。 表1 大鼠癫痫发作后不同时间段海马CA1区Caspase3基因的阳性表达 注：与A组比较，*P0.01；与B组同时点比较，#P0.05 3 讨 论 近年研究发现,在人类颞叶癫痫患者以及电点燃或化学点燃、局部或系统给予致痫剂等各种癫痫模型中,用形态学或生化的方法均证实癫痫发作,特别是癫痫持续状态后,神经元死亡具有典型的凋亡特征4,5。癫痫发作所致的神经元损伤中凋亡普遍存在的另一证据是与凋亡有关的各种基因的表达在癫痫后出现了改变。 Caspase3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶,处于级联反应的核心位置,发挥非常重要的作用,被称为死亡蛋白酶。如果在Caspase3激活之前进行干预,可以有效抑制凋亡的发生6。Li Wen等7研究证实，癫痫大鼠海马神经元凋亡与Caspase3 mRNA的表达密切相关，Caspase3在神经元凋亡过程中起着重要作用，提示Caspase3参与了癫痫发作神经元凋亡，其特异性抑制物能减轻癫痫发作导致的脑神经元损害。 bFGF又称细胞生长肽，是1974年由美国学者Gospodarowicz 首先从牛垂体中提取的一种分子量为12kD的多肽因子。bFGF在神经系统中发挥着重要的作用, 如促进胚胎及成熟的脑组织中各种胶质细胞和神经元前躯细胞的增生和分化，维持神经元存活、促进神经元分化，对神经元损伤起保护和再生作用。 本实验采用戊四氮腹腔注射的急性化学点燃模型,因既往组织学分析揭示，戊四氮点燃癫痫模型海马CA1区神经元丢失和齿状回苔藓纤维发芽与人类癫痫极其相似，因此采用该大鼠癫痫模型对人类癫痫的研究具有一定的参考意义8。系统给药与脑内注射药物或电点燃相比,可以避免人为脑部创伤所致的病理变化,有利于神经化学和组织形态学方面的研究。另外，本实验采用癫痫后bFGF腹腔注射的方法，是因为研究已证实，虽然在正常情况下，外源性bFGF不能通过血脑屏障，但当脑组织受到各种损伤时，bFGF可以通过血脑屏障发挥其神经保护作用。而本实验结果显示6 h内C组与B组阳性细胞数及染色度无显著统计学差异(P0.05)，考虑原因为急性期血脑屏障破坏不完全，bFGF不能充分透过血脑屏障而发挥作用。因此腹腔给药的方法有一定局限性，在以后的研究中，可采用侧脑室注射药物的方法进行对比。120 h后2组间的差异亦无统计学意义，则可能是由于癫痫所引起的病理变化已达到稳定所致。 本实验结果显示，大鼠癫痫发作后Caspase3的表达具有时间依赖性，2448 h达到高峰，证实了癫痫所致神经元凋亡的高峰时段，与Henshall等9在致痫大鼠模型中用TUNEL法标记细胞凋亡的结果相近。本实验从细胞水平证实，bFGF对癫痫大鼠海马神经元有保护作用，并有一定的时间依赖性。但因实验未深入到分子水平，因此仍不能就其作用机制作出合理解释，需在以后的实验中进一步探讨研究。 目前虽有新的抗癫痫药不断面世，但仍有相当一部分难治性癫痫患者不能用药物控制发作。在我们了解了bFGF的对癫痫的神经保护作用后，可做进一步深入地研究，以期应用于临床抗癫痫的治疗。现今bFGF已应用于治疗脑血管病、颅脑外伤和颅脑手术后遗症、脑萎缩、脑血管病性震颤麻痹、脊髓病变及周围神经炎等各种疾病，并显示出较好的疗效，相信bFGF在癫痫治疗领域一定会有广阔的应用前景。晋升网（）设有论文学院、考试学院、在线投稿等，本网站致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标【参考文献】1 Erkanli G,Ercan F,Sirvanci S,et al.Timedependent changes in distribution of basic fibroblast growth factor immunoreactive cells in rat hippocampus after status epilepticusJ.Neurol Res，2007,29(8):816823.2 Liu Z,Holmes GL.Basic fibroblast growth factor is highly neuroprotective against seizureinduced longterm behavioural deficitsJ.Neuroscience，1997,76(4):1 1291 138.3 Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulationJ.Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32(3):281294.4 Manno I,Antonucci F,Caleo M.BoNT/E prevents seizureinduced activation of caspase 3 in the rat hippocampusJ.Neuroreport，2007,18(4):373376.5 Schindler CK,Pearson EG,Bonner HP.Caspase3 cleavage and nuclear localization of caspaseactivated DNase in human temporal lobe epilepsyJ.Cereb Blood Flow Metab，2006,26(4):583589.6 Sharma S,Ravichandran V,Jain PK.Prediction of caspase3 inhibitory activity of 1,3dioxo4methyl2