AQUITY UPLC Q-TOF micro液质联用操作步骤+图文版.doc

48Waters UPLC/Q-TOF操作手册目录一、开关机标准程序2二、主要操作界面3-4三、质谱方法和液相方法的编写5-11四、正负离子模式切换方法12-13五、质谱校正方法14-31六、单质谱以及液质联用方法32-38七、图谱处理及电子版拷贝方法39-46八、注意事项47九、清洗离子源和样品瓶方法47一、开关机标准程序（一）开机标准程序1、开启电脑电源2、开启Q-TOFmicro总电源开关、电子电路的电源、内建式电脑电源（Embedded PC,EPC)，此时仪器内建式电脑会自动开启并与电脑主机（Host PC)连线。3、开启Masslynx软件，此时Masslynx将自动侦测是否有仪器，即Q-TOFmicro连线上，又得话才可以控制仪器，不然，在侦测不到仪器的状态下将维持只有软件单独使用的状态。4、检查冷却水系统是否连接妥当。5、在质谱调谐页面（MS Tune)的选项（Options)选择抽真空（Pump)，当真空够好的时候才能开始做实验。真空的好坏可以从三个地方来看，一是从真空计的读值判断，点击真空（Vacuum)的图示：即显示真空计，如欲恢复原扫描分析峰设定，则点击其左侧分析峰（Peaks)图示。6、 从仪器面板上查看，LED灯如为固定绿灯，则真空度为正常，如为橘橙则表示真空度较差。7、 在开始操作质谱仪前，务必先平衡MCP。平衡MCP是逐渐缓慢增加电压以赶走吸附于MCP的水气。平衡MCP的步骤： （1）确定飞行管的压力小于310-6mbar至少一小时。 （2）确定Capillary、Flight Tube、MCP电压皆为0。 （3）切换至Operate。 （4）接着增加Fight Tube电压（一次增加500，当反馈值达到输入的值再做一次增加，直至数值为3000）。 （5）由OPtions中选择MCP conditioning，可见到 （6）设定start为100，stop为2700，Duration为600，step为5。按下面Start即开始平衡MCP。（2） 关机标准程序（当长时间停电或是移机等特殊情况必须关机时）1、 泄真空：在质谱调谐页面（MS Tune)的选项（Options)选择泄真空（Vent)。2、 关闭Masslynx软件。3、 关闭内建式电脑电源（Embedded PC,EPC）、电子电路的电源及Q-TOF micro总电源开关。4、 关闭电脑电源。二、Masslynx软件主要操作的四个界面主界面 质谱调谐界面 MS Tune 液相方法编辑界面 Inlet Method液相系统界面三、质谱方法和液相方法的编写在主界面的项目列表中右击选择Add增加列表项数。 然后依次编写Fille Name、File Text、Ms File、Inlet File、Bottle、Inject Volume对应的项：1、File Name直接写成样品名称，注意不能和其它重复。2、File Text标记，若是单做质谱，标记为MS+或MS-，若是液质联用，标记为UPLC-MS+或 UPLC-MS-。3、Ms File项中右击选择Edit 出现 点击MS Scan图标，根据需要填写各参数，包括： （1）Mass中填写质量扫描范围（注意标样校正值应包含在内）：Low Mass，High Mass。 （2）Method中选择离子模式和信号存档方式：Ionization Mode选择相应的离子模式，Data中选择数据存档方式（Centroid的档案在一个质量只选择一个代表性的点储存，得到棒状质谱图，资料量较小，占用空间少；Continuum的档案每个质量都会储存多的资料点，可以描绘出分析峰的图像；MCA的资料类似Continuum，但会将所获取的每张图谱自动作平均。一般情况下选择Continuum；组学研究选择Centroid）。 （3）Time中填写采集时间：Start Time，End Time（单做质谱时一般为2 min，液质联用视液相方法时间而定。 （4）Scan Duration中Scan Time为每个扫描所花的时间，一般设为0.5s；Inter Scan Delay为扫描间隔，一般为0.1s。 （5）Cone Voltage 中设定锥孔电压，可以与调谐窗口一致，也可自己设定。 （6）Reference Scan中Cone Voltage设定适合标准品（LE）的锥孔电压（做完单点校正后即将其改正）；Frequency设定挡板切换分析路和校正路的频率，一般为10s；Scan Time设定标准品扫描时间，一般为1s。 若要做子离子扫描（即二级质谱），点击MSMS图标，填写二级扫描信息，包括： （1）Masses中填写Set Mass母离子分子量，子离子扫描质量范围Low Mass，High Mass。 （2）Time中填写该母离子二级扫描的时间范围Start Time，End Time。 （3）Reference Scan中要填写校正用标准品（LE）在相应离子模式下的分子量：LE+ 556.2771，LE- 554.2615。 （4）Collision Energy中填写二级扫描碰撞能量。 （5）其他同一级设定。质谱方法编完成后在File/save as另存一个文件名，然后在主界面的Ms File项中右击选择Browse提取该方法。4、 Inlet File项中右击选择Edit出现点击Inlet ，出现：在Solvents项标注流动相：A是水相，A1管路通常用来装超纯水或一定浓度甲酸水或一定浓度氨水等，A2管路通常用来装异丙醇；B是有机相，B1通常用来装乙腈，B2通常用来装甲醇。在Gradient项下：Time流动相梯度或等度变化时间、Flow流速、%A和%B两种流动相的比例变化、Curve变化曲线。在Run time项填写液相方法运行时间，质谱方法的时间一般与此一致。（若是单做质谱，选择100%有机相（甲醇或乙腈），流速为0.1ml/min，液相方法为100%相应有机相，时间5分钟左右，可根据实际情况调节时间长短。点击Autosampler，出现：编写Run time，Temperature（Column柱温，若是生物样品，还应设置Sample样品室温度为4）并标注上下限，若进样瓶加了内衬管还要进行提针操作，方法是点击Advanced图标，出现： 选择Needle Placement，填写提针高度（一般2mm）注：a、Inlet项中的Run time 、下面方框流动相的流动时间、Autosampler界面的Run time三者应一致，否则容易出错，质谱方法中的采集时间一般也与之相同。b、如进样瓶中加了内衬管，一定要记得提针的操作，以免针头受损。液相方法编完成后，File/save as另存一个文件名，然后在主界面的Inlet File项中右击选择Browse提取该方法。5、Bottle项中填写对应的样品盘号数。6、Inject Volume项填写进样体积（10L）。上述几项都改写完成后，点击save保存即可。四、正负离子模式切换方法先将MS Tune界面的Capillary、Flight tube、reflectron和mcp detector电压慢慢降为0点击右下角方框的Standby，图标变成红色切换（ion mode项下选择需要的离子模式，calibration项下选择校正模式）点击右下角方框的Operate，图标变成绿色等待一会左下角方框的Acquire由灰变黑后，再慢慢将上面四个的值调到3000、5630、1780、2300(ESI+)/2500(ESI-)。五、质谱校正方法每次切换正负离子模式和清洗离子源后都必须进行质谱校正（重要）。1、单点校正（即Lock mass 的校正：LE 正离子 556.2771 负离子 554.2615）电压 Capillary : 3000V左右 Sample Cone : 视响应情况调节，并将其保存到质谱方法的ConeVoltage中 Extraction Cone : 一般02温度 Source Temp : 80120 Desolvation Temp : 350气体 Cone: 50L/hrDesolvation: 350600L/hrLock Spray 为Reference 状态打开Lock mass，调节各参数使相应信号保持200左右（Scan time 1.00时，若Scan time 0.50时，则相应强度保持100），点击左下角Acquire图标采集信号。采集1分钟左右即可停止（点击手样图标）提取色谱图，选取该段信号提取质谱图Center处理观察LE特定离子峰的分子量信息，跟标准分子量对比。如果误差在1md以内（即小数点后1位相同），则可进行下一步的多点校正；如果误差超过1md，则按照修改Iteff值的方法修改Iteff值之后再采集，直到符合误差允许范围。Iteff值的修改公式为：Iteff值的修改位置在质谱调谐界面Options项下TDC Settings.中，如图：2、多点校正（即甲酸钠的校正）以正离子模式为例：Ion Mode 选择ES+Calibration 下打开Uncal文件校正文件在下拉框选择ESI-NaFormate-Pos文件Lock Spray改为Analyte状态进样针吸满配好的甲酸钠样品放到自动进样泵，质谱操作界面点击进样针，调节流速及相关参数，使响应强度大部分保持200左右（Scan time 1.00时）最高不超过800，点击质谱界面左下角Aquire图标，采集信号，当累加质谱图中分子量最大的离子峰强达到1500以上停止采集，center处理，保存图谱。Calibration界面Calibrate项下From File打开刚才保存的文件名，点击History选择之前保存的文件 OK，即出现实测值和真实值之间的对比图以及相应的标准曲线。如果ppm在5以内，则在Finished项下选择Accept Calibration，然后在Calibration界面File项下选择Save As保存刚才的校正文件（一般按时间命名，如2012-6-15+）；如果ppm超过5，则重新校正，重复上面操作直到ppm小于5。3、验证 取消液相方法运行，步骤如下：在液相方法界面Tools项下点击Instrument Configuration.出现点击Configure，出现点击Nest，出现如下对话框，Select Pump选择None点击Nest，出现如下对话框，Select Auto Sampler选择None点击Nest，出现如下对话框，Select Detector选择None（因现在紫外检测器故障）点击Nest，出现如下对话框，点击Finish出现如下对话框，选择No即可 主界面中建一个验证的进样序列（以甲酸钠溶液为验证的测试样品），编辑方法： 离子扫描范围 一般1001000（根据需要测定的分子量范围设定，如果要测大于1000分子量的物质，则相应扩大范围）。 离子模式ES+ 采集方式Continuum 扫描频率Scan time 1.00 Reference Cone Voltage和Lock mass校正中的Source Cone一致 质谱界面Ion Mode 选择ES+，Calibration打开刚才保存的校正文件（如）进样针吸满配好的甲酸钠样品放到自动进样泵，质谱操作界面点击进样针，调节流速及相关参数，使响应强度大部分保持200左右（Scan time 1.00时）最高不超过800，主界面运行序列采集信号，当累加质谱图中分子量最大的离子峰强达到1500以上停止采集，Mass Measure处理复制全图谱打开桌面Massdiff软件，打开甲酸钠正离子质荷比对照列表点击粘贴如显示绿色且状态表示为PASS，则表明校正成功，否则需重新校正。六、单质谱以及液质联用方法 单做质谱也要经过液相，单做质谱有专用柱（BEH C18预柱：2.15mm，1.7m）。1、准备样品要求：样品配置浓度（约510mg/ml）、样品高速离心取上清液进样、瓶盖切口、样品盘放紧（放盘的标记在Bottle栏，如1:3表示一号盘三号位）、样品不含盐。2、准备流动相分别用干净的瓶子装入有机相和水相，超声10min，将相应管路滤头放入流动相中。在液相系统界面点击Control下Prime A/B solvent.脱气三分钟。 3、编写质谱和液相方法，方法参见质谱方法和液相方法的编写。4、打开Lock mass，MS Tune窗口打开气体开关、毛细管电压Capillary 3000、调节Source temp（一般80-100）、Desolvation temp（一般300或350）。 选择离子模式，若要进行离子模式切换，方法参见离子模式切换方法。 校正，参见质谱校正方法。5、 因校正时液相部分被取消，所以运行样品前要先将液相部分连接（与取消液相方法相反）。方法如下： 在液相方法界面Tools项下点击Instrument Configuration.出现点击Configure，出现点击Nest，出现如下对话框，Select Pump选择Waters Acquity点击Nest，出现如下对话框，Select Auto Sampler选择Waters Acquity点击Nest，出现如下对话框，Select Detector选择None（因现在紫外检测器故障）点击Nest，出现如下对话框，点击Finish出现如下对话框，选择No即可如上一系列操作后，液相即连接成功，液相方法界面将如下图6、 液相系统界面选择相应有机相打开流速（从0.1慢慢升），平衡到初始条件，并在液相方法界面点击载入方法： 7、载入后等流动相系统平衡到稳定状态（判断标准是色谱柱柱压差在50psi内，柱温及样品室温度达到设定范围）即可点击进样序列进样采集：8、进样序列运行完毕后用100%有机相继续冲10分钟再停止流速。关闭Lock Mass.关闭MS Tune界面Capillary 为0（慢慢降），Source Temp为80，Desolvation Temp为0,关闭气体开关，检查气体阀响应值是否为0。如图：关闭氮气罐气体阀。将质谱管路从液相部分取下用密封袋封住管口。冲柱：水相-有机相95：550：500：100依次冲1520分钟。若水相或者有机相用了酸，应先将其换成纯水和纯有机相排气后再冲。若是单质谱，选择100%相应有机相冲柱1520分钟即可。冲柱结束后停止流速，取下色谱柱放好，水相泵用水-有机相混合液（乙腈-水1:1）保存。七、图谱处理及电子版拷贝方法图谱处理方法：1、 选择色谱图：主界面项目列表中选择相应样品名，点击chromatogram 出现下面色谱图2、 色谱图背景扣除：色谱图中display项下tic.，选择BPI3、 提取质谱信息：色谱图中选择相应的峰，按右键不放拖动，出现该峰对应质谱图4、 质谱校正：质谱图Process项下点击Mass measure.，各参数如图，Lock mass（脑啡肽）正离子用556.2771，负离子用554.2615，其他不变5、离子的元素分析：质谱图Tools项下Elemental Composition，输入相应分子量，得到可能的元素组成电子版拷贝方法：注意移动设备不要带病毒（光盘或已格式化的专用U盘）A.用桌面Multimedia Center Home软件拷贝（适用于光盘）：1、 打开桌面拷贝软件，选择Data项下Direct-to-Disc，点击Add Data，数据文件导入，地址是：System(c:)-Masslynx-Default-Data；序列列表文件导入，地址：System(c:)-Masslynx-Default-Sampledb.2、 数据导入完成后，做系统兼容性处理：Make Compatible.B.直接传输数据（适用于U盘）不打开U盘，直接在C盘找到相应Data和Sampledb发送即可。C.对外测试的样品打印的纸版需要保存一份相同的电子版，拷贝方法是在色谱图谱上点击“照相机”样的图标，再