利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症.doc

利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症 限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如：（2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或DNA探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA分子在复制或转录时将DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。根据DNA分子杂交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。2008天津30-下图为人-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，-表示基因的不同功能区。从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分所含有的上百个核苷酸，mRNA根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。2007江苏38单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。-ACGTGTT-ACGAGTT-正常的血红蛋白基因B突变的血红蛋白基因b图注:限制酶酶切点 突变碱基 探针杂交区域 带谱III112234凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱(1)从图中可见，该基因突变是由于 碱基对改变(或A变成T) 引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。(2)DNA或RNA分子探针要用 放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(ACGTGTT)，写出作为探针的核糖核苷酸序列 UGCACAA 。(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠的胎儿-lII-4中基因型BB的个体是 一l和一4 ，Bb的个体是 一3 ，bb的个体是 一2 。解析:比较基因B和和突变后的基因b的碱基组成，发现它们的差别仅是B基因一条链某一位点上的碱基A突变成b基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因B经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿-1-4的基因型时，可以这样认为：基因型Bb的个体同时带有B基因和b基因，所以其应同时含有与B基因对应的二条带谱，与b基因对应的一条带谱（这也可以从-1和-2得到验证）。符合这个条件的仅有-3。同理，基因型为BB的个体应仅有与B基因相对应的二条带谱，符合条件的是-1和-4。bb的个体是只能是含有与b基因相对应的一条带谱，为-2。作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA链上的碱基是A时，作探针用的RNA链上的碱基应为U。 通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇