科技创新申请书.doc

项目编号河南城建学院大学生科技创新基金项目 申 请 书项 目 名 称： 韭菜内生菌的分离及功能研究 申 请 者： 指 导 教 师： 王莲哲 所 在 系 部： 生物工程系 申 请 日 期： 2011. 03 河南城建学院大学生科技创新基金管理办公室二 一 一 年 制一、基本情况1项目情况项目名称韭菜内生菌的分离及功能研究项目性质教师科研课题中的子项目； 小发明、小创作、小设计等；开放实验室或实习基地中教学计划之外的综合性、设计性、应用性、创新性实验项目； 专业性研究及创新研究项目； 社会调研、文艺创作项目；可操作性强的自主创业项目； 其他有价值的研究与实践项目。项目类别理工类人文社科经管类（含文学、经济、政治、社会、法律、教育等）项目来源 自主立题 教师指导选题成果形式自然科学类学术论文； 科技制作、发明；人文社科经管学类学术论文、文学艺术作品、社会调研报告。其他 起止时间自 2011 年 3 月 至 2012 年 3 月申请金额3千元2申请者情况姓名性别年龄民族系部年级专业兼职电话Email3项目组成员情况姓名性别年龄专业分工每周工作时间签字4指导教师情况姓名王莲哲职称讲师专业生物化学与分子生物学E-mailW系部（盖章）电字2二、立题依据1研究意义：植物内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌在植物体内广泛存在，在植物的根、茎、叶、花、果实和种子等器官组织的细胞或细胞间隙均有发现。植物内生菌包括内生真菌、内生放线菌和内生细菌。具有丰富的生物多样性，而且还包含大量未被认知的新物种，植物内生菌成为巨大且宝贵的微生物资源库。大量研究表明，宿主植物与内生菌常具有相同或相似的次生代谢产物合成途径。在长期协同进化的过程中，宿主植物与内生菌相互影响，使内生菌产生十分丰富的次生代谢产物。目前已证实植物内生菌的作用主要有促生作用、产生活性成分(如抗肿瘤物质、抗菌活性成分、抗病毒物质等)、抗病虫害作用、外源基因载体、降解环境污染物等。通过对植物内生菌的研究，在生物防治、医药卫生等领域有广泛的应用潜力。随着生活水平的逐步提高，人们对饮食健康的关注日趋加深，化学防腐剂、化学农药等引起的安全问题也引发人们的思考。且由于抗生素的滥用病原菌耐药性的增强，寻找安全、高效、低毒、天然的新型抗菌药剂势在必行。植物内生菌能产生对抗药菌株有抑制活性的新物质，有些活性物质可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，对癌症具有一定的治疗作用，所以内生菌可作为新型药物的筛选源。有些宿主植物拮抗内生菌可以提高植物的抗病性，可以代替化学农药对病害进行有效的生物防治。将筛选出的功能性内生菌结合菌种改良、发酵工艺优化可以实现有益内生菌的产业化，具有广泛的应用价值。因此，对植物内生菌的开发将具有十分重大的经济意义。韭菜，属百合科多年生草本植物，除食用外，种子和叶等还可入药，具健胃、提神、止汗固涩、补肾助阳、固精等功效。韭菜除含有丰富的纤维素、蛋白质、微量元素等外，还含有皂苷类、黄酮类物质以及抗菌肽等多种活性物质, 具有抗菌杀虫、抗衰老、抗突变、温肾助阳等多种功效。根据内生菌与宿主植物协同进化的共生关系，分离韭菜内生菌，可以筛选出能产生抗菌活性物质、抗肿瘤活性物质等的内生菌，深入研究其活性功能，以获得有应用价值的微生物菌种，为进一步发酵生产有用的次级代谢物以及韭菜病害的生物防治打下基础，具有广泛的经济效益和应用价值。2.国内外研究现状：植物内生菌的研究从19世纪中叶开始，Be Barry(1886)首先提出内生菌“endophyte”一词。目前对于植物内生菌的研究主要集中在药用植物、某些粮食作物和牧草上，主要是分离与功能研究，从植物分离内生菌，再分析内生菌产生的活性成分，将内生菌与药用植物共培养，再检测活性成分的产量，利用生物化学的方法对活性成分进行分析筛选，从而发现新的有价值的化合物。刘吉华等从喜树的根、枝条、叶和果实中分离纯化了48株内生真菌， 对喜树内生真菌产生的喜树碱结构类似物进行初步筛选，并进一步进行了抑瘤实验，结果发现7个菌株的发酵液对HL-60细胞增殖具有显著的抑制活性。方美娟等从三尖杉植物中分离出2种拟青霉属真菌C56和C65，其发酵液对HL-60细胞和人口腔上皮癌细胞(KB)均有很高的细胞毒活性。田小曼等从不同采样点青蒿的各种组织中分离得到12株内生真菌，测定了各内生真菌对8种病原真菌具有拮抗作用。刘杰风等利用选择培养基从健康的番茄、辣椒、茄子3种植株进行内生菌分离，共得到53株内生细菌，其中有20株对青枯病原菌有不同程度的拮抗作用。国外方面：印度学者从喜马拉雅地区盾叶鬼臼的根状茎中分离到1株能产芳基四氢萘木脂素的内生真菌毛栓菌，在其发酵液中鉴定出有鬼 臼及鬼臼毒素糖苷类衍生物，研究表明这些物质具有抗氧化、抗癌及抗辐射的活性。巴西学者从1种樟科植物的健康叶片中分离出1种弯孢属内生真菌， 该菌产2种新的苯丙吡喃类衍生物和两种已知的苯丙吡喃类物质，某些对 He La细胞和CHO细胞的增殖都有一定的抑制作用。从南美可可树树干和豆荚中分别分离出2株新的内生真菌，经检测它们均有抑制宿主病原菌的作用。Sighn等从1株未鉴定的内生真菌CR115的发酵液中分离到1种十二萜化合物，其对多种细菌和白色念珠菌有抑杀作用。从健康泽漆中分离出2株植物内生放线菌，并测得2株菌株对T MV的抑制率分别为87和72。这些研究都证明了内生菌普遍具有产活性代谢产物的能力。3.研究目的： 通过对韭菜内生菌的分离，结合抗菌性检测、抗肿瘤活性检测，生化分离手段初步分析检测活性成分，以筛选可以产生新的药用先导化合物的内生微生物资源，为进一步确定这些菌株发酵液中抗菌活性物质的组分及相应的化学结构，并评价其应用前景奠定基础。4.主要参考文献：1Haruhisa K，Nahoko T，Yoshiteru ONovel aromatics bearing 4-O-methylglucose unit isolated from the oriental crude drug Bombyz batryticatusJTetrahedmn Lett，2004，45(2)：3673702Cheng Z H，Yu B Y，Guo Y L，et at Microbial hydroxylation of quinovic acid glycoside by Streptomyces e ACCT13273JChin J Chem，2006，24(1)：95983 TaechowisanT, Peberdy JF, LumyongS. Isolation ofendophyt-icactinomycetes from selected plants and theirantifungalactivi-tyJ. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,19(4): 381-385.4 涂璇,黄丽丽,高小宁,等.黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定 J.植物病理学报, 2008, 38 (3): 244-2515 贺荣乔.植物内生菌成为我国当前微生物研究领域的热点J .微生物学通报，2009，36 (1)：16 孔庆军，王莹，葛彬棉花内生菌筛选纯化及抑菌效果研究J安徽农学通报,2009，15 (17)：79-817 王娜娜，秦宝福，刘建党，等香附子内生菌的分离鉴定及活性检测J中国农学通报，2009，25 (8)：46-498 李文华，李乐，吴云锋，等泽漆内生菌的分离及抗病毒内生菌筛选J. 西北农业学报，2008，17(2)：285-288 9程媛媛，雍彬，张超，等华重楼内生菌抗菌肽的分离纯化及其特性J微生物学报，2009，49(4): 498-503三、研究方案1研究内容与方法：本研究拟根据韭菜的不同品种、不同发育阶段分别从根、叶、花、果等不同部位分离内生菌并研究其功能，拟解决的关键技术如下：一、 内生菌分离及鉴定（1） 内生菌培养：取韭菜不同部位外植体消毒并研磨成匀浆，稀释梯度后涂平板培养。（2） 内生菌初步统计：以形态培养特征为主，并结合生理生化反应对不同培养基平板上生长的微生物进行初步统计分类。（3） 内生菌纯化及保存：对不同菌落形态的微生物分别进行纯培养并保存。二、 内生菌功能研究（1） 抗菌性实验：采用琼脂块法进行抑菌实验。分析对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及黄瓜病原菌等的拮抗性，以及对肿瘤细胞增殖的抑制能力。（2） 内生菌酶活性测定：通过分离培养内生菌生理生化反应测定纤维素酶活性、几丁质酶活性、蛋白质酶活性、壳聚糖酶活性等生理活性。（3） 内生菌活性物质提取：分离得到的内生菌进行发酵培养，超声波破碎细胞，匀浆液通过层析、分离、纯化活性物质，并SDS-PAGE，WESTERN BLOT，HPLC，毛细管电泳，质谱等方法鉴定。（4） 功能性内生菌的分子测定：通过对筛选出的功能性内生菌16s rRNA序列测定比对，以确定内生菌种类归属。2研究目标和创新点：研究目标：本课题拟对韭菜的内生菌进行分离与功能研究，以期分离得到一种或多种有益的内生菌，具有较好的抗菌性、抗肿瘤性或产生具有活性的次级代谢产物，以丰富药用植物内生菌资源，开发无毒害的新型药物，或是增强药用植物的抗病性等方面提供依据。创新点：近年来很多药用植物的内生菌研究均在广泛进行，而对韭菜的内生菌分离研究较少。本课题研究以期分离出有益内生菌，为开发药品、开发生物拮抗剂以提高韭菜抗病性、或通过有益内生菌共培养提高韭菜活性物质产量等进一步研究奠定基础。本研究不但具有现实的理论意义，还能产生巨大的社会效益。3预期结果和形式：预计能从韭菜中分离得到一种或多种有益内生菌，鉴定该菌的类别，并分析其产生的活性物质及功能。通过本研究比较不同品种韭菜中内生菌种类、数量和生理作用，为将来开发新型无毒性的抗菌剂，实现活性物质产生菌的产业化,对于有效地开发利用药用植物内生菌资源,保护野生珍贵药用植物提供依据。4研究进度及安排：2010.3-6：在前期工作基础上，对韭菜不同品种、不同部位进行内生菌的筛选、分离培养及菌种鉴定，初步确定韭菜内生菌的种类、数量，研究其与宿主品种等的关系。2010.9-12：对分离到的内生菌进行抗菌性、抗肿瘤性等功能研究，并对功能性强的内生菌进行次级代谢物的分析、鉴定。分子鉴定筛选出的活性物质产生菌的分类和进化地位。2011.1-3：补充和完善前期工作，整理数据，撰写研究报告。5所需仪器设备：培养箱、超净工作台、发酵罐、荧光显微镜、蛋白质分离纯化制备装置、液相色谱仪、气相色谱仪、凝胶成像系统、原子吸收仪、凯氏定氮仪、旋转蒸发仪等所需的实验设备，以及无菌工作室、细胞培养室、分子实验室等相关实验室，基本满足完成上述内生菌分离、鉴定及生理功能研究的要求。6经费使用计划：原料试剂费：22