细胞免疫荧光的方法(自己实践记录).doc

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。2、用预温的1PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!11、1PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。细胞免疫荧光简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min*34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2*5min6.羊血清封闭：37度，20分钟7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时8.4度PBS洗净，3min*5次9.二抗37度小于一小时10.37度PBS洗净，3*5min凉干封片(封闭液PH8.5)不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：1）实验前一天，将细胞接入铺有2222mm（或2424mm）盖玻片的六孔板中。2）第二天，待细胞汇合度达到70左右开始进行染色步骤。3）用新鲜配制的2（或4）多聚甲醛固定细胞10分钟。4）PBS洗三遍，每次5分钟。5）用0.2-0.5tritonX-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。6）PBS洗三遍，每次5分钟。7）2BSA或者10二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS洗两遍。8）加入1抗，室温孵育1小时。9）PBS洗三遍，每次5分钟。10）加入二抗，室温孵育30-45分钟。11）PBS洗四遍，每次5分钟。12）加入0.5ug/mlDAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst33258）。13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。14）加入20ul封片剂封片。15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的细胞免疫荧光I、步骤：一、 固定：PBS 5min3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。固定液覆盖细胞，RT 静置15min。PBS 5min3次 振荡洗涤。二、 通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。PBS 5min3次 振荡洗涤。三、 封闭：封闭液覆盖标本表面37孵育1h。四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。4孵育过夜，第二天37复温1h。PBS 5min3次 振荡洗涤。五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。37避光孵育60min。PBS 5min3次 避光 振荡洗涤。六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置10min。PBS 5min3次 避光 振荡洗涤。七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。八、镜检，4避光保存。II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，5080mlPBS，加热至60，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶