动物转基因技术研究与应用进展.doc

生物技术概论 -240b2592ade8f0bf9d7dc43234c79baa.pdf动物转基因技术研究与应用进展姓名：吴兴利 学号：20090328学院：动物科技学院 专业：动物检疫 班级：09级一班摘要：文章综述了目前使用的各种转基因动物技术显微注射法、反转录病毒法、扎刺法、精子载体法、电击法、胚胎干细胞介导法和基因打靶技术,并简述了各种方法的优缺点。同时对转基因动物在提高生产性能、异种器官移植、基因治疗和生物反应器等方面的研究现状做了较系统的概述。并指出了目前存在的问题,对其前景进行了展望。关键词：转基因动物;转基因技术;外源基因导入细胞；1 引言自Palmiter 等 ( 1982) 把大鼠生长激素基因导入小鼠一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活将重组胚直接或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的输卵管受精卵获得超级巨鼠以来 ,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣 ,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。 转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一 ,其应用已 广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育 种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命 ,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展 ,显示出诱人的应用前景 2动物转基因技术简介 转基因技术就是将外源基因或体外重组的基因转移到动物的受精卵内,使其在动物体内得到整合和表达 , 以产生具有新遗传特征或性状的转基因动物 ,并能将新的遗传信息稳定地遗传给后代 ,获得转基因系或转基因群体 ,或者是将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制 ,并在一定的时间内表达外源蛋白。前一种情况是一种永久表达 ,又称为整合表达 ,这种表达具有遗传性 ,对改变动物的性状具有重大意义;后一种情况是一种暂时性表达 ,不能遗传给后代 ,只在当代表达 ,这种表达为人和动物疾病进行基因治疗和基因预防奠定了理论基础。其中 外源基因导入细胞的方法有：2.1 显微注射法显微注射法是用微吸管在显微操作仪下将一定量的外源基因直接注入到合子的原核中,将合子培养移植给受体动物。1980年Gordon又将SV40的TK基因整合后的质粒以显微注射法注入小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。随后利用该方法,转基因兔、猪、绵羊、鱼、牛和山羊也都相继获得成功,该方法的优点是基因导入可靠;缺点是成功率低。2.2 反转录病毒转染法此方法是把重组的逆转录病毒载体,包装成高滴度的病毒颗粒去感染卵裂期胚胎,于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中,整合到宿主细胞的染色体上,使这种细胞具有新的遗传性。1974年Janenisch等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中获得转基因小鼠。此方法的优点在于:宿主范围广泛,基因整合率高。对于显微注射比较困难的禽类早期胚胎而言,是一种非常适用的方法,可以直接将载体病毒注射到未经孵化的鸡受精卵的卵黄中。其缺点是:载体病毒不能再结合用以产生新的有感染的病毒,包裹的核酸大小有限制,不需要长末端重复子(LTRs)干扰可进行组织特异性表达,获得有感染多种宿主细胞的病毒。2.3 扎刺法扎刺法是先将胚胎放在含有目的基因的培养液里,然后用细针扎到细胞或细胞核里,针快速拔出,此时外源基因就进入细胞核,细胞膜结构的流动性随之而关闭,胚胎内进入的溶液很少。这种方法比显微注射快,对胚胎损害小,但转基因频率低。2.4 精子载体法精子载体法是用精子作为基因转移的载体(Vector)生产转基因动物。1989年Lavitrano利用精子载体首先在小鼠上转基因试验成功,后来利用此方法相继在兔、猪、羊、鸡的转基因试验中也获得成功。以精子作载体的方法,虽然在许多动物已获得成功,但这种基因如何被精子带入卵内,尚未弄清,因此,这种方法仍不断被探索和改进。2.5 电击法电击法也叫电场转移基因法,其原理是外界的高电压脉冲可以改变细胞膜的结构,使膜产生可变性的电穿孔,从而使得一定大小的DNA分子通过细胞膜进入细胞核,并进一步整合到宿主DNA上。1992年,Lnoue等利用该方法在鱼类的转基因研究中获得成功。2.6 胚胎干细胞介导法将胚胎干细胞植入正常发育的囊胚腔之后,会很快地与受体内细胞团聚集在一起共同参与正常胚泡的发育,因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现个体的基因转移。Evans等(1981)用不同培养系统从小鼠囊胚的内细胞团分离并建立了多潜能干细胞。此方法的优点是:基因整合率高,胚胎干细胞在体外可以大量培养,并可以在细胞水平上筛选转化子,并可在特殊的可选择的位置诱导突变,从而进行最大可能的基因修补工作。其缺点是:胚胎干细胞需要预先选择和克隆基因转移型细胞。2.7 基因打靶技术此方法是将细胞基因组的某一序列克隆并加以改造后重新导入细胞中,这一序列就可以与基因组内的同源序列发生重组,从而将改造后的基因转移到基因组内,实现基因的定位突变。1988年Mansour首次采用该技术使转移基因在体内的定点整合成为现实,产生了敲除特定基因的转基因小鼠(Knockout小鼠)。此方法的优点在于消除了盲目性和偶然性,并且整合位点精确、表达水平高。其缺点是产生的串联重复序列不稳定,能自发进行二次同源重组。2.8 其它 除上述几种转基因方法外 ,为了某种特殊需要也探索一 些其他方法 ,如激光导入法、受体介导的基因转移法、脂质体 介导法、电转移法、微弹轰击法等 ,但总体看来仍不十分理想 ,效率不高3动物转基因技术的应用现状 转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物 生殖细胞 ,由此稳定整合到动物基因组 ,并能遗传给后代的 动物。目前 ,转基因动物的研究主要包括三个方面: ( 1) 利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。（2）利用转基因动物制造具有生物活性的产物 ,包括器官移植和生物反应器。（3）利用转基因动物确定研究手段 ,包括建立疾病模型和发育调控。 3.1利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性 3.1.1培育动物新品种,提高生产性能常规育种改良畜禽品种进展较慢,而且有些种畜的生产性能已达到相当高的水平,很难获得较大的进展,利用转基因技术,将所需的优良基因直接转入待改良群体中,从而培育出具有优良品质的转基因品系。生长激素(GH)基因是转基因研究中运用最早的基因,1985年Hammer,1989年Rexroad和1993年Pursel分别获得转人的生长激素释放因子(hGRF)的转基因小鼠、转基因母猪和转基因绵羊。提高了猪的生长速度和饲料利用效率,胴体脂肪率也明显下降。1994年,德国成功培育出转入生长素的转基因猪,使世界上出现了壮如小牛的“超级猪”。3.1.2提高动物的抗病力基因转移是降低家畜疾病易感性的免疫策略之一,对一些种属特异性的疾病,如果可以从抗该病的动物体中克隆出有关的基因,并将其转移给易感动物品种,则有希望培育出抗该病的品系。此外,在对畜禽类病原体基因结构进行深入研究的基础上,可将病原体致病基因的反义基因导入畜禽细胞,使侵入畜禽机体的病原体所产生的mRNA不能表达,从而起到抗病作用。湖北省畜牧所与中国农科院兰州兽医所合作,将抗猪瘟病毒(HCV)的核酶基因导入猪体中,获得抗猪瘟病毒的转基因猪。3.2利用转基因动物制造具有生物活性的产物 ,包括器官移植和生物反应器。3.2.1器官移植长期以来,科学家一直在试图利用动物器官来使垂危病人起死回生,弄清超急排异反应的机理后,近年来国外学者对防止补体介导的异种移植后超急排异反应提出了2种方法:一是通过转基因技术,即通过克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中,使之在供体心血管内上皮表达。采用这种转基因动物心脏进行异种移植后,就可避免超急排异反应的发生,其效果类似于同种心脏移植。3.2.2作为生物反应器利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常规畜产品,是目前世界上转基因研究的热点之一。作为生物反应器的转基因动物主要是将某些对人类医用价值高的蛋白质编码导入动物机体,使这些转基因动物成为生物反应器。其中,通过动物乳腺生物反应器生产人类药用蛋白的研究已取得了初步成功。乳腺是一个外分泌器官,乳汁不进入体内循环,不会影响转基因动物本身的生理代谢反应,从转基因动物乳汁中获取的基因产物不但产量高,易提纯,而且表达的蛋白经过充分的修饰加工,具有稳定的生物活性。1991年英国科学家将人的1-抗胰蛋白酶基因转入绵羊受精卵成功地获得了5只转基因绵羊,从绵羊乳中纯化的1-抗胰蛋白酶与人血浆中的1-抗胰蛋白酶具有相同的生物学活性。90年代,国家“863”计划已将转基因羊乳腺生物反应器的研究列入重大项目,并取得了一系列可喜成果。中国科学院与扬州大学合作获得促红细胞生成素和人乙型肝炎表面抗原基因两乳腺表达的转基因山羊。1998年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得表达人凝血因子转基因山羊。利用这一技术获得的人凝血因子可用于解除血友病患者的痛苦。3.3 利用转基因动物确定研究手段 ,包括建立疾病模型和发育调控。 3.3.1基因治疗将人类癌症及遗传病的致病基因转入动物,就能更好的探索其发病机理和治疗途径,为人类癌症和遗传病的研究提供了良好的动物模型。基因治疗主要是将正常的外源基因植入人体靶细胞以取代有缺陷的基因,恢复该基因的功能或提供一种新的治疗功能,以改善相关症状,达到治疗疾病的目的。首例基因治疗为1980年Cline等对酪重症-地中海贫血患者进行了基因治疗研究,用磷酸钙沉淀法将含有正常-珠蛋白基因的Pbr322质粒导入骨髓细胞,输回到患者体内,移植310周内,患者血细胞中有外源基因序列,12周后消失,临床症状未见改善,但证实外源基因可以引入骨髓细胞,后者可在体内继续增殖,且无副作用。1990年美国科学家对腺苷酸脱氨酶(ADA)缺陷的重度联合免疫缺陷病(SCID)患者进行了基因治疗获得成功,标志着基因治疗有更广阔的应用前景。4动物转基因技术存在的问题动物转基因技术目前已取得较大进展,研究也不断深入,但仍然存在着许多急需解决的问题。4.1 转基因动物的成活率低转基因动物在获得生产性状提高的同时,也留下一些后遗症,如死胎和畸形率较高,患关节病、胃溃疡、肾病和生殖力丧失症的动物较为普遍。4.2 理论基础积累不足和技术不完善转基因动物研究存在理论基础积累不足和技术不完善等问题,使得转基因动物基因组存在随机整合、调节失调、遗传不稳定以至于表达效率不高等问题。4.3 转基因动物生物反应器产品的安全性问题。这包括转基因动物的产物的分离和提纯,表达产物的结构和生物活性与人体蛋白的相似性的问题,只有从表达产物除去能引起人类变态反应的非人类蛋白,并且产品与人体蛋白有足够的相似性,才能应用于人类的健康事业。4.4 各学科合作不足转基因动物涉及生物学、畜牧学、医学、分子遗传学和细胞遗传学等多学科门类的知识,需要加强各学科研究人员的通力合作5 展望转基因技术的诞生标志着人类在生命科学的发展史上进入一个崭新的阶段。转基因技术的发展不仅促进了其它学科的发展,而且带动的产业将推动世界经济的发展。研究最深入、应用最广泛的转基因动物生物反应器,已走向商业化应用阶段,展示了广阔的应用前景。据国外经济学家预计,大约10年后转基因动物生产的药品就会鼎足于世界市场,转基因动物生物反应器产业将成为最具高额利润的新型工业。参考文献1 孙含笑,陆大祥,等. 转基因技术理论与应用 第一版M . 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