分子遗传学复习总结 2.doc

第二章 基因的结构和功能一基因一酶学说：该学说具体体现了基因和酶之间的关系，表明每个基因控制单个酶的合成或激活其活性。转化：通过裸露的外源DNA传递遗传信息。转染：是转化的一种特殊形式。用于原核细胞时，其外源DNA特指离体的phage DNA来感染感受态的细菌，并在其中表达；用于真核细胞时对任何裸露DNA的吸收都成为转染。接合：通过细胞与细胞之间的直接接触。遗传信息单向传递到受体的过程。转导：一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。自主发育：不受周围细胞的影响，按照自身基因型发育的现象。非自主发育：受周围细胞的影响，不按自身基因型发育的现象。1902 英 Garrod.A首先研究了四种遗传病:黑酸尿病 白化病 胱氨酸尿病 戊糖尿病；1952年发现糖原贮积症（Von Gierke氏病）病人缺乏葡萄糖-6-磷酸酶 芽盘移植实验第二节 人类酶缺陷的遗传基础一、半乳糖血症二、 白化病 三、苯丙酮尿症 四. 莱-尼二氏症第三节 遗传咨询和产前诊断一、 遗传咨询（Genetic counseling）：询问先征者的完整病史，家族史；查阅McKusick,V.A:MendlianInheritance in Man 是否为遗传病，遗传类型，发病风险？通过产前诊断，决定是否终止妊娠。二、产前诊断（prenatal diagnosis）：指征是：（1）亲体为携带者；（2）母亲曾生育过先天性异常的婴儿；（4）35-40岁以上的高龄孕妇；（5）曾有多次流产，早产和死胎的孕妇；（6）亲体曾多次接触过放射线或在妊娠早期服过一些胎儿致畸药物。采集标本的方法：羊膜穿刺抽取羊水，收集胎儿脱落细胞;从宫颈粘液中获取绒毛膜细胞;直接从子宫控中吸取绒毛膜细胞;超声波可用于产前诊断神经管缺陷，如无脑儿，脊椎裂和水脑儿。胎儿镜（fetoscope）又称羊膜镜或宫腔镜。产前诊断的方法：细胞学，生物化学，分子生物学三、携带者的检出：方法： (1) 染色体核型分析 (2) 酶活性的检测 (3) 分子生物的方法。实例：神经节苷酯贮积病GM2-I型Tay-Sachs症，家族性黑蒙性痴呆，氨基已糖苷酶A）缺乏症四、分子病（molecular diease）：分子病是指由于基因的突变引起了蛋白质分子结构的改变而导致的疾病，如镰形细胞贫血（sickle cell anenia）。第四节 基因的精细结构和顺反测验(应为百度文库的原因，此处删除了)当顺式有功能，而反式没有功能时，突变位点在同一顺反子内；当顺式有功能，而反式也有功能时，突变位点在不同顺反子内。第三章 遗传物质的分子结构和性质第一节 核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点？：在体细胞中含量稳定；在生殖细胞中含量减半；能携带遗传信息；能精确地自我复制；能发生变异；（DNA RNA是遗传物质的证明）一、遗传物质的发现：1928年Frederick Griffith 转化实验；1944年，Avery在离体条件下完成转化。1952年，Hershey和Chase 噬菌体感染实验二、 RNA也是遗传物质：1956年A.Gierer和G.Schraman发现烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV），其遗传物质是RNA。1957年美国的Heinz Fraenkel-Conrat和B.Singre用重建实验证实了这一结论。第二节 DNA和RNA的化学组成及双螺旋模型一、DNA和RNA的化学组成二、 DNA双螺旋模型的诞生：Watson & Crick建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：（1）1938年W.T.Astbury & Bell用x衍射技术研究DNA。1947年拍摄了第一张DNA的衍射照片，并推断DNA分子的结构是： 柱状； 多核苷酸是一叠扁平的核苷酸； 核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为3.4。（2）1951年Pauling和Corey运用化学的定律来推理，而不做具体的实验， 建立了蛋白质的-螺旋模型；（3）晶体学者美J. Donoh & Chargaff的指点。（4）R.Franklin & Wilkins在1952年底拍得了DNA结晶X衍射照片。三 、双螺旋模型 (double helix model)双螺旋模型有以下特点：(1) DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。(2) 双螺旋的直径为2nm；螺距为3.4nm，上下相邻碱基的垂直距离为0.34nm，交角为36。 (3) 两条链反向平行，即两条链的方向相反；(4) 糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(5) 糖与附着在糖上的碱基近于垂直。(6) 碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(7) DNA双螺旋有大沟（major or wide groove）和小沟（minor or narrow groove）的存在。第三节 DNA的结构和性质 一、DNA二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。它包括： 疏水作用； 范德华力； 磷酸基的负电荷斥力模型中的碱基配对有何重要性？A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键；A-T对和G-C对的几何形状一样，使双链距离相近，使双螺旋保持均一；碱基对处在同一平面内。不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构；为DNA半保留复制奠定了基础。二、 双螺旋结构的构象变异DNA的构象现已知有A，B，C，D，E，T，Z 7种。生理条件下：B 三种主要构象：B引起DNA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。立体异构：分子中原子互相连接的方式和次序相同（构造相同）,但在空间的排列方式不同而出现的异构现象。平面偏振光和旋光性 光是一种电磁波，它的电场或磁场振动的方向与光前进的方向垂直。 在普通光线里，光波可以在垂直于前进方向平面上的任何方向振动。(一)左旋DNAZ-DNA的结构特点（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。(3) G的糖苷键呈顺式(Syn) ，使G残基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。(5) 大沟消失，小沟窄而深。(6) 每个螺旋有12bp。ZDNA存在的条件(1) 高盐：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L(2) Pu,Py相间排列：（3）在活细胞中如果m5C,则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生Z型。(4) 在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样，可和磷酸基因结合，使B-DNA转变成 Z-DNA。(5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境。(6)负超螺旋的存在生物学意义：(1) 可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在；(2)在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活性，小核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录有关。(二)右旋DNA：目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。 三、DNA的三级结构所谓DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体超螺旋：（Supercoied） 松驰型DNA （relax form）。超螺旋（Supercoied） DNA，负超螺旋 正超螺旋 检测DNA三级结构的方法：密度梯度离心 凝胶电泳 电镜观察原核生物DNA的三级结构：绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。 超螺旋的定量描叙：White方程： L=T+WL（Linking nnmber）：链环数或称拓扑环绕数，指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是(1) L是整数；(2) 在 cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变；(3)右手螺旋对L取正值。W（Writhing number）：扭曲数，即超数旋数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时，W取负值。T（Twisting number）：缠绕数，即双螺旋的圈数。其特点是：(1) 可以是非整数；(2) 是变量；(3) 右手螺旋时T为正值。超螺旋的量度可以用超螺旋密度来表示：=（L-T）/T 在天然DNA中， 约为-0.05第四节 DNA的变性与复性变性或解链：对双链进行缓慢地加温，使氢键断裂，双链解开，产生单链的分子的过程成核作用：复性过程中互补的两条链首先是中心部分互补碱基对之间形成氢键，接着像拉拉链一样，其余部分随之形成双链。又称为拉拉链作用。复性或退火：核酸分子在变性后分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双链的过程。DNA的复性对片段有两个要求：(1) 互补顺序的碰撞和排列；(2) 碱基的正确配对和氢键的形成。一、DNA变性物理性质发生变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为增色效应（hyperchromic effect）。双链DNA的A260=1.00（浓度为50g/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；单链DNA的A260=1.37；游离碱基或核苷酸的A260=1.60。解链温度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度。即是变性温度范围的中点。影响变性的因素：高温、酸、碱、尿素、甲酰胺影响值的因素：外部条件:如温度和正离子的浓度:浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍,Tm增加16.6内部条件：GC含量及分子类型当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm = 69.3+0.41(G +C)%，或GC%=（Tm-69.3）2.44二、DNA复性复性动力学公式根据复性动力学公式我们可以知到些什么？(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；(2）反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线；(4) 通过C0t1/2值可测原核生物基因组的大小；已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec COt1/2 （大肠杆菌基因组DNA）/9M.sec = 任何基因组大小/4.2X106bp(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线不同；(6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。单一顺序和重复顺序复性动力学曲线的区别 真核生物DNA有重复顺序，原核物多为单一顺序。(1) 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点，而重复顺序常有多个拐点。(2) COt 比值变化范围不同：原核生物的COt比值小于100,真核生物的COt比值大于100。影响复性反应的因素(1) DNA片段的大小；(2) DNA的浓度；(3) DNA复杂性;(4) 温度。最佳复性温度一般比Tm低25C。(5) 盐的浓度：复性时要求盐的浓度达到足够高，为什么？复性反应中如何知道单链已结合成双链？可以通过哪些法来检测？(1) 减色效应：测定光密度，即OD值，DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2) 羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链。（）羟基磷灰石柱层析第五节 核酸分子杂交技术分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的共同特点(1)都是应用复性动力学原理；(2)都必须有探针（probe）的存在。探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA或RNA顺序。一、核酸分子杂交的基本原理DNA变性 方法 热变性：90-100 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应预杂交：鲑鱼精子DNA封闭非特异性杂交位点分子杂交的基本方法：Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交Southern杂交：DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southern 杂交的主要步骤：待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备Southern杂交杂交结果的检测：基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测 酶切后DNA片段琼脂糖凝胶电泳检测Northern 印迹杂交：检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同：靶核酸：RNA。RNA电泳 。转膜：不需变性斑点印迹杂交：将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上。优点：简单、快速、可同时检测多个样品原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究。不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高。准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。核酸原位杂交的基本步骤：玻片原位杂交：细胞或组织的固定载玻片；组织细胞杂交前的预处理；去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白；膜上分子杂交；探针的选择和标记；杂交结果检测。探针的标记探针的种类：cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针。标记物：核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等；非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等Western 杂交印迹法(Western bloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。主要步骤：蛋白质样品的制备；SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳；蛋白质的电转移：NC膜；靶蛋白的免疫学检测：靶蛋白于第一抗体（一抗）反应；与标记的第二抗体（酶标二抗）反应；显色反应：酶促反应 第四章 基因组和染色体基因组：是指一个单倍体的染色体数目（遗传物质的总量）。原核基因组含有大量单一顺序，仅有少量的重复顺序。真核基因组含少量单一顺序和大量重复顺序。原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA。第一节原核生物基因组的结构特点一、类核的结构E.coli 2.4109 Da，42000 Kb（1300微米），闭合环状，约编码2000个基因。类核（nucleoid）：原核生物的DNA位于细胞中央 支架 (scafford）：100个DNA环组成，每个环长40Kb，13微米。每200bp就有一个负超螺旋（=-0.05）,即基因组中含5%的负超螺旋。 超螺旋以两种状态存在：（1）自由状态的超螺旋，可在环内传递张力。（2）蛋白结合超螺旋受到束缚，不能传递张力。二、重叠基因(overlapping gene) 三、质粒(plasmid) 特点:双链环状DNA分子；带有一些特殊基因(抗生素抗性基因)；具有复制起始区；可经整合到宿主的染色体中，和细菌染色体同步复制；质粒类型1.抗性质粒：带有抗性基因，可使宿主细菌对某些抗生素产生抗性2.致育因子：可以通过接合在供体和受体之间传递遗传物质，其基因组具有转移区，重组区和复制区3.Col质粒:含编码大肠杆菌素基因。4.降解质粒:这种质粒编码一种特殊蛋白，可使宿主菌代谢特殊的分子，如甲苯或水杨酸。5.侵入性质粒。如根癌农杆菌中的Ti质粒。第二节 真核基因组的复杂性 分子量约为31012道尔顿 长度为2106Kb，形态为线状，约编码100万个以上的基因。人类细胞在二倍体的核中DNA长约30亿个碱基对 估计编码3万个基因，每条染色体含碱基8千万至3亿不等。现已有5千个基因被编目，1900个基因已进行了染色体定位，600个已被克隆分离出来。若将一个细胞中每条染色体的DNA首尾彼此相接，全长约200cm。染色质(chromatin):从细胞中获取的DNA和蛋白质的复合物常染色质 异染色质在染色质中和结合的有两类蛋白：组蛋白非组蛋白三、 染色体的高级结构10nm的核丝；30nm 螺旋管；放射环模型；螺旋环模；放射、螺旋环共存模型；袢环模型；螺旋折叠U.K.1988)等模型；侧环模型 第三节 着丝粒和端粒一. 着丝粒：由三个功能区组成；中部的元件(II)由8090bp组成，A+T含量高，90%；左侧的元件(I)含有PuTCACPuTG顺序（Pu是嘌呤）；右侧的元件(III)是由26bp组成的保守区，此区也是A-T丰富区；所有真核生物的着丝粒功能都相同，但其DNA却具有种的特异性。二：端粒：共同特点：每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。Cn(A/T)m ，其中n1，而m=14。在端粒区域中有一种特殊的不连续排列，产生单链断裂的形式，这种结构并不能被连接酶将缺口封闭起来，而在正常情况下连接酶是可以作用DNA链上的缺刻（nick）。提纯的天然的端粒区可直接用E.Coli DNA多聚酶I进行缺口平移(nick translation) 。在端粒区的最末端可能带有3-OH的单链末端回折成了发夹(hairpin)结构。端粒的双链部分中含有T2G4的顺序在3末端，排列方向是朝向染色体的中心部位。细胞中，端粒是和一些非组蛋白相结合，形成复合体，常表现为异染色质或构成染色体的末端结节。 端粒的功能：保持染色体的稳定；使线形DNA顺利复制；影响染色体的行为；可能控制细胞的寿命；和核骨架的组成有关第四节 染色体的核型和分带1核型(Karyotype) ：在一个细胞中全套的中期染色体称为核型2染色体带型G带：iemsa染色 ；最常用先用加热或蛋白水解酶进行预处理，然后用染料染色，结果呈现清晰特异的带。反映了染色体上的丰富区。用电镜扫描可在带区见到收缩的痕迹，但不可长期保存。C带；Q带：芥子奎吖因（guinacrine mustard）染色；直接将未染色的中期染色体染色，在与带相同的区域产生另外的荧光带在荧光显微镜下清晰可见。其？感性较强。T带；N带；R带:Reverse；是和带相反的带，即带的深染区正是带的浅染区。反之亦然。用常规颜料染色。第五节 单一顺序和重复顺序一、单一顺序 (Unique sequence )在基因组中有一个或几个拷贝。不编码真核基因(4070%)原核基因(大多)编码 二、短片段重复顺序（1）正向重复又叫顺向重复；（2）反向重复；（3）回文顺序：是一种旋转对称。特点是正读反读意思都一样。存在于各种蛋白质的结合位点。 三、长片段重复顺序轻度重复顺序: 在基因组中含有2-10拷贝 ，酵母tRNA基因、人和小鼠的珠蛋白基因等。中度重复顺序: 长约300bp基因组中约有10-几千个拷贝的顺序。如 rRNA 和 tRNA 基因。tRNA 基因一般都分布于基因组中，而 rRNA常集中分布于核仁形成区。基因家族（gene family）：在真核生物基因组中，来源相同、结构相似、功能相关的基因。基因簇（gene family）：相同或相关的基因排列在一起。分散的基因家族其成员不在同一基因簇（gene cluster）内，串联基因家族的成员都集中串联在一起。有的基因家族成员不仅结构和功能不同，表达的时间也不同。孤散子（orphons）：由串联重复顺序中派生出的单个基因，远离其家族，表达会发生改变。假基因：基因家族中因突变而失去功能的基因不能产生具有生物活性的蛋白质。加工假基因（processed pseudogenes）。有以下的特点：缺少正常的内含子；3末端有多聚腺苷酸；5端的结构和mRNA的5端十分相似； 两侧有顺向重复顺序的存在 。对以上特点作何推论？因此人们推测它似乎和mRNA一样经过了转录后加工，因此也称其为加工假基因；四 、Alu家族 ：长约300bp；Alu顺序也称为短的分散因子；由RNA多聚酶III转录的。在基因组中30 万个拷贝； 在170bp处有一AluI 的酶切位点； 由两个130bp的串联重复顺序组成； 在二聚体的右半部有31bp插入序列，此插入顺序来自7SL RNA。 Alu顺序有何应用价值？短的分散因子(short interspersed elements, SINEs):由RNA多聚酶转录的.长的分散因子(long interspersed elements, LINEs):在哺乳动物中,由RNA多聚酶转录的.L1 家族：长6500bp左右 称为长的分散因子；在基因组中约6万个拷贝；由RNA多聚酶II转录的。属于一种转座因子五高度重复顺序： 卫星DNA (satellite DNA)：卫星DNA(satellite DNA)是一类高度重复序列 DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心，离心速度可以高达每分钟几万转；此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从离心管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。根据荧光强度的分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA，这种DNA的GC含量一般少于主带中的DNA，浮力密度也低。 隐蔽卫星DNA(cryptic satellite) 自私 DNA（selfish DNA）伊甸园 DNA (Garden of Eden DNA；小卫星 (minisatellite ) 重复序列可变数 DNA指纹（DNA fingerprints）第六节 C值矛盾C值矛盾(C-value paradox) ：值和生物结构或组成的复杂性不一致的的现象。可能产生的原因是什麽？断裂基因间隔顺序 (spacer):基因间不编码的部分(有转录间隔区和不转录间隔区)间插顺序(intervening sequence) :基因内部不编码的区域,即内含子(intron) 可编码的内含子:成熟酶,内切酶一、内含子的发现二、内含子的结构特点(一) 内含子和外显子的分布 (二) 内含子的相对性 三、内含子的生物学意义：有利于储存较多的遗传信息；有的内含子可编码内切酶。成熟酶归巢调控 提高进化速率第五章 DNA的复制第一节半保留复制的验证半保留模型（semioconservetive model）全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining）5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR）斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型型复制 第二节参与DNA复制的酶和蛋白一、快停突变与慢停突变快停突变：把细菌培养温度提高（42 45）复制迅速停止。快停突变所涉及的产物和链的延伸有关慢停突变：将细菌培养温度提高，DNA合成并不立即停下来，延续一段时间后合成才会停止。慢停突变表明突变的基因和复制起始有关。筛选出与DNA合成、延伸有关的蛋白和酶。二、原核生物复制的酶系统（一）DNA聚合酶1.DNA聚合酶的共同特点（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。复制的特异性（复制的忠实性）：(1)合成前错误控制：能够通过匹配的化学特点加以识别，检查进入的碱基是否和模板互补，这是一种合成前的预防措施。(2)校正控制：在新的碱基加到链上以后，来检查碱基是否配对。发生错配时，会把刚加上去的错误碱基切除。2.DNA聚合酶的结构和功能DNA聚合酶有6个结合位点：(1) 模板结合位点；(2) 引物结合位点；(3) 引物3OH结合位点；(4) 底物dNTP结合位点；(5) 53外切酶结合位点；(6) 35校正位点。 （二）DNA聚合酶的功能 特点：主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换。使用的模板范围较宽（1）有引物的ssDNA（线状或环状）。（2）有缺口的dsDNA（无论大小）；（3）有切口（nick）的双链DNA。1. 53聚合功能 2. 35外切活性3. 53外切活性(1)切口平移（nick translation）；(2)链的置换；(3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性（三）DNA多聚酶的结构全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于,复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。（四） DNA连接酶其作用机制是分三步进行：1、EATPEAMPppi 在E.coli中， ENADEAMPNMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化 3、活化的5PO4与相邻的3OH作用形成35 磷酸二酯键，并释放出AMP。单链结合蛋白又称为双螺旋去稳定蛋白；由177个aa组成；在E.coli 中以四聚存在；分子量为74KDa ，每个分子可以覆盖32nt；在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。（六）解旋酶(helicase)第三节复制的起点、方向和终点一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法（denaturation mapping）4. 双向电泳法不同生物复制起点和方向： E.coli定点、双向对称复制。T7在近一端的17处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5时基因组进行双向复制。 质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。 mt DNA进行D（displaced loop）环复制。真核有多个复制起点（i），双向等速复制。（一）环状DNA复制复制起始区的结构特点是：（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（914个GATC）8个GATC较保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA；起转录激活作用。哪些DNA进行滚环复制?真核rDNA的扩增,F因子DNA的转移,裂解途经的复制, X174,M13.G4等单链环状DNA噬 菌体 第二阶段复制都是进 行滚环复制的.（二）线状DNA复制DNA中间起始复制DNA末端起始复制线性双链DNA的复制有的是从一端开始的:腺病毒（Adenovirus）29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus)；腺病毒DNA全长35937 bp,线性双链，两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。（三）复制的终止1.E.coli的复制终止(环状DNA复制终止)现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus基因的产物Tus， Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止2.线性DNA的复制终止两个5有空缺的分子通过3端凸出的重复序列互补配对。DNA多聚酶从3端延伸填补起这个空缺，留下最后的裂隙由连接酶封闭，产生了一个大分子串联体。由限制酶在连接处交错切割，产生3 凹端，由DNA多聚酶在3-OH上延伸填满新的空缺，产生两条完整的双链。 第四节 复制的过程一、半不连续复制 1、冈崎片段：任何一种DNA聚合酶合成方向都是从5向3方向延伸，而DNA模板链是反向平行的双链，这样在一条链上，DNA合成方向和复制移动方向相同（前导链），而在另一条模板上却是相反的（后滞链）。那么在复制叉中新链是如何合成的呢？Reiji Okazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到前导链连续合成，滞后链分段合成。这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。细菌冈崎片段长度1000-2000核苷酸，真核生物冈崎片段长度100-200核苷酸。（1）脉冲标记实验：以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素3H标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长10002000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大2050倍。（2）脉冲追逐实验：早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）。 形成前导链小片段的原因：细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApol却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成AU对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险”，防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。第二道关是尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。复制体和回环模型：双螺旋复制是同时复制的：每一个复制叉含有特别大的多聚体复合体，它是一个不对称的二聚体，可能同时催化两条链。在电镜下观察到双螺旋DNA聚合酶也同样具有两个活性部位 ；复制体（replisome）：是由解旋酶、引发酶和DNA Pol 全酶组成的复合体。回环模型： DNA合成时，沿着复制叉的方向移动。后随链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。特点：聚合酶和引发体联系在一起可以协调它们的作用；复制体中的DNA Pol 是二聚体；后随链是形成回环复制的。 二、真核生物的复制、真核生物聚合酶和有关蛋白、真核生物复制特点：1基因组中有多个复制起点； 2一般要等第一轮复制结束后第二轮才开始。3真核的复制起点到两边的复制终点称为一个复制子或一个复制单位。DNA开始合成的位置，一个初始起点(或者双向复制起点-大多数起点是双向的)，两侧有一些二级起点。初始起点经常是0.5-2kbp长，而二级起点可跨越50kbp，因此称为起始地带4真核和原核复制子的大小是非常相似的，但复制的速率真核要比原核慢得多；5真核的复制起始点的数目和复制单位的大小是随着细胞的特点变化而改变的，如不同的生长速率的细胞和不同组织的细胞。6并非所有的复制子都同时进行DNA复制。而是有一定的起始时间顺序。不同类型的细胞复制起始的顺序也不同。 、真核生物复制起始区结构。(1)T蛋白具有解链酶活性，通过水解ATP解开双链，RF-A立即和单链结合，使之稳定；(2)复制叉移动一段距离，pol-引发酶复合物结合到复制区，合成第一段RNA引物；(3)RF-C结合到引物上，使pol合成第一条冈崎片段；(4)到前导链和后滞链的分界区，pol从单链上解下来，再结合到新的复制叉处合成后滞链。(5)pol，RF-C和PCNA结合到前导链的第一条冈崎片段3端开始合成前导链。(6) SV40的复制可能也形成复制体，后滞链形成回环 酵母的自主复制区：1ARS、2发挥复制起点的功能，但是过量的。3酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列；4ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。5A区为15bp,其中11个保守，称ACS 、。有复制起始子的功能；6B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。7B3是ABF1、结合区。ORC：由6个亚基组成相当于Dna A和 的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA 。Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factor。ABF1（转录因子）结合于B3三、原核和真核生物复制体系比较四、与组蛋白的组装五、真核复制终止：（1）首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的RNA与凸出的3引物配对；（2）以RNA为模板，在DNA3端上从头合成DNA；（3）延伸六个Nt；（4）合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板新合成的3移动，引物再和模板配对，就这样循环往复，周而复始。最后延伸的3端再回折，以GG配对的方式形成发夹结构，产生端粒。 六复制的调控第六章 转录1957年 Crick提出了中心法测。1970 Crick又作了部分修改第一节 信使的发现转录: 基因表达时以DNA的一条链为模板合成RNA的过程。RNA聚合酶：催化合成RNA的聚合酶Jacob和Monod预言:（1）这种“ 信使”应是一个多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息；（3）它们至少是暂时连在核糖体上；（4）其碱基组成反映了DNA的序列；（5）它们能高速更新。Jacob和Monod将它定名为:信使RNA或mRNA。第二节 RNA的酶促合成一. RNA合成的特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5-3方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的（8）RNA无校正能力。RNA合成和DNA复制的区别（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制 时两条链都可作为模板；（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，不断向两侧延伸，新合成的链和母链形成子链；（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物；（4) 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；（5）聚合酶系不同。第三节 细菌基因的转录一细菌的RNA聚合酶 RNA pol和DNA pol也有2点不同：（1）RNA pol没有任何校对功能；（2）能起始新的RNA链。 RNA pol 执行多种功能(1) 识别DNA双链上的启动子；(2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。二. 原核生物转录的起始延伸(一) 启动子（promoter）的结构和转录起始：转录基序与启动子结合,启动转录的起始。一般将DNA 上的转录位点定为+1来排序，其下游为正值，其上游为负值。原核生物不同基因启动子有共同特点：(1)结构典型,都含识别（R),结合（B)和起始（I）位点;(2)序列保守; (3)位置和距离都比较恒定；(4)直接和多聚酶相结合； (5)决定转录的启动和方向。(6)位于基因的5端；1. -10序列：-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnow box）。保守序列为T80A95T45A60A50T96位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。其功能是:(1) 与RNA pol紧密结合；(2) 形成开放启动复合体；(3) 使RNA pol定向转录。-10序列对转录的效率影响：TATAATAATAAT，转录效率下降,称为下降突变（down mutation）。TATGATTATAAT，转录效率上升，为上升突变（up mutation）。以上突变为何会影响转录效率？前者可能由于 的堆集能要小于 的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少。2. -35序列：-35序列又称为Sextama盒，其保守序列为（T82T84G78A65C54A45）其功能是:(1) 为RNA pol的识别位点。亚基识别-35序列，为转录选择模板(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关。3. 转录起始位点（I）。：转录开始时模板上的第一个碱基；在原核中常为A或G；而且位置固定；（二）转录的起始：1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；2. 起始识别：全酶与35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物；3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；4.酶移动到I，第一个rNTP转录开始,因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternary complex）。RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:(1) 和1/3的RNA pol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中； (2) 其中半数的核心酶从事转录；(3) 余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中；(4) 估计数量很少的全酶是游离的。三 原核生物转录的终止终止子（terminator,t）：强终止子内部终止子，无需其他因子的帮助，就能终止核心酶的转录 弱终止子 需要因子（又称为依赖性终止子）才能终止核心酶的转录。强终止子的结构特点：(1) 有回文结构存在；（2）茎的区域内富含G-C；(3) 强终止子3端上有6个U；以上结构特点在终止中起何作用？由它转录成的RNA形成颈环结构阻止RNA聚合酶的前进。使茎环不易解开由于其模板形成连续UA配对，较易打开从而便于释放RNA四 RNA聚合酶和噬菌体转录策略：小的噬菌体利用宿主的RNA pol进行转录。大的噬菌体自己编码RNA Pol。宿主RNA转录T7的部分染色体，包括基因1。T7的基因1编码RNA聚合酶。其它基因的产物可抑制宿主RNA聚合酶。T4噬菌体编码一种蛋白和E.coli的RNA pol酶相互作用，使宿主的聚合酶只转录噬菌体的基因，而不能转录细菌的基因。第四节 真核生物的转录真核生物的转录和原核生物转录的不同点：(1) 原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；(2) 启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件；(3) 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。一.真核的RNA聚合酶二真核生物的启动子启动子最为复杂，它和原核启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用（6）不直接和RNA pol结合；(7) 需多种转录因子介入。类基因的启动子和调控区：核心元件：TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语 称为金砖其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50常在-25左右，相当于原核的-10序列。其作用是：(1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子。(2) 影响转录的速率。起始子：起始点一般没有同源序列；mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成称为起始子（initiator,Inr).（在原核CAT起始序列也有这种情况）。一般由PY2CAPY5构成；位于-3+5；提供RNA pol 识别。无论TATA是否存在，Inr对启动子的强度和起始位点的选择都是重要的 。现已纯化了Inr 结合蛋白。上游元件 略 远端调控区：增强子：又称远上游序列其特点是： 具有远距离效应。 无方向性。 顺式调节。 无物种和基因的特异性。 具有组织的特异性。 有相位性。其作用和DNA的构象有关。 有的增强子可以对外部信号产生反应。增强子为什么具有远距离作用呢？（1）拓朴效应；拓朴效应说认为增强子的作用是诱导染色质结构变化，使核小体产生DNaseI敏感区。（2）滑动模型；（3）成环模型。 衰减子：负调节上下游远端。沉默子：阻遏基因的转录第七章 遗传密码和遗传信息的翻译系统。第一节 遗传密码的破译一. 遗