茶中酯化型儿茶素的提取及应用.doc

茶中酯化型儿茶素的提取及应用一摘要 茶是相当受欢迎的饮料之一。茶对人体的保健有正面的效应。这些效应与茶中的茶多酚有关，其中最主要的物质为儿茶素类物质的单体及其衍生物，其中又以酯化型儿茶素的比例最多。 本研究的第一部分介绍以烷基乙醇分配萃取，聚酰胺及木屑吸附试验，希望能以简单且较安全的程序制备含低咖啡因的酯化型儿茶素精致物。在分配萃取试验中，先将茶粉以少量的水在低湿下润湿，再以烷基乙酯（乙酸乙酯和丁酸乙酯）进行数次分配萃取，然后以高效液相层析仪检查有机溶剂的主要成分。其次，再以聚酰胺粉末及木屑进行吸附，然后用水将为吸附的成分洗掉，接着以不同比例的乙醇冲提酯化型儿茶素。由HPLC分析结果显示，乙酸乙酯的精致效果较好；聚酰胺的吸附效果较好。本研究的第二部分是检测儿茶素的体外抗氧化能力。DPPH的清除能力，与Trolox当量抗氧化能力（TEAC）。结果显示TEAC法由于灵敏度比较高反应快，不仅可以应用于批次分析，更有可能设计成管柱后直接进行抗氧化检测。关键字：茶叶，酯化型儿茶素，烷基乙酯萃取，聚酰胺吸附，木屑吸附，HPLC,抗氧化能力检测。Abstract Tea is one of the most popular drinks.tea is helpful to our humanbeings.mostly,esterified catechins is usually used . The first part of this research is a trial to get a refined tea preparation of high esterified catechins simple and sfer processes .the procedures used including organic solvent(ethylacetate ,EA and butyl acetate ,BA)partition and polyamide or wood-dusts adsorptions .firstly ,tea powder was wetted with small amount of water ,then partitioned with the organic solvent (EA or BA )for several times .and then the composition in organic solvent examined by HPLC .secondly ,tea infusion after hot water treatment was adsorbed either treated wood-dusts or home-made polyamide power .After washing out unbound components (mainly caffeine and free or oxidized catechins),esterified catechins were then desorbed with the aqueous alcohol solution of different concentration of methanol. The results showed that EA was better than BA .on the other hand , home-made polyamide power was better than treated wood-dusts. The second part of this study is to optimizing two convenient in vitro antioxidant assay procedures (DPPH scavenging and TEAC activity).the 96-well micro-plate with ELISA reader was used for rapidly evaluating the anti-oxidative activity of the components in extract of natural product after HPLC .the results showed TEAC assay can be applied not only for batch analysis ,but may also be designed as a direct post-column assay procedure.Keywords : tea esterified catechins ,alkyl acetate partition ,polyamide ,adsorption ,wood-dust adsoption ,DPPH scavenging ,TEAC assay ,HPLC.目录1.绪论2儿茶素的简介2.1儿茶素的分类2.2 儿茶素的化学结构3儿茶素的保健功能与机能型4.儿茶素的制备4.1儿茶素萃取液的制备4.2 HPLC萃取液的制备4.3儿茶素的抽取4.4儿茶素的纯化5.儿茶素抗氧化能力的检测5.1儿茶素的自由基清除能力的检测5.2 儿茶素的总抗氧化能力的检测6.儿茶素的来源与应用7.致谢词8.文献二，正文1. 绪论儿茶素（catechins）1902年被发现于茶叶中，结构1925年被提出，1955至1960年之间其立体化学性质的研究报告陆续发表，从1970年左右，许多学着开始进行儿茶素生理功效的研究，至今对其在人体的吸收及功效，已经有清楚的了解.关于儿茶素，早期是以茶单宁称之，后来发现儿茶素并无单宁的化学性质，真正的单宁可与蛋白质形成不可逆结合，但儿茶素类物质并无此性质。2. 儿茶素的简介2.1儿茶素的分类 类物质属于黄烷醇系列化合物，因此可统称为黄烷醇类，又黄烷醇类属于类黄酮类化合物之一，所以儿茶素又可称为类黄酮素。而这一系列化合物皆属于多酚类，姑亦称谓茶多酚类。儿茶素类物质可细分为两类，分别为游离型，包括：儿茶素（C），表儿茶素（EC），没食子基儿茶素（GC，表没食子基儿茶素（EGC），酯化型儿茶素是由游离型类儿茶素与没食子酸进行酯化反应而成，包括：儿茶素没食子酸酯（CG），表儿茶素没食子酸酯（ECG），没食子基儿茶素没食子酸酯（GCG），表没食子基儿茶素没食子酸酯（EGCG）等.在天然茶叶中以ECG和EGCG为主。当茶叶经高温萃取极可能会使ECG异构化成GCG。酯化型儿茶素的化学结构中含有的羟基（OH）越多，越能阻止自由基在生物体内所造成的伤害。2.2儿茶素的化学结构儿茶素的种类繁多，其基本结构式与没食子酰基（G）的结构式如下图所示，G基接在基本结构式的R2位置，随着R1,R2位置上所接官能团基的不同，有多种不同的儿茶素衍生物会出现。3. 儿茶素的保健功能及机能性 儿茶素类对于人体的生理与保健作用方面，发现其具有抗菌，抗病毒，抗炎，抗突变，抗氧化性，以及促进T和B淋巴球，自然杀手细胞的增生等功效；甚至可以降低血中三酸甘油酯与胆固醇的量，避免低密度脂蛋白LDL的氧化与粥状动脉硬化的发生。关于目前研究出的儿茶素类物质的机能性功能如下所示：抗氧化防止油脂，肉类制品的氧化 ，防止天然色素褪色去除自由基，消除活性氧，提高体内整体抗氧化能力螯合金属离子，降低金属离子促氧化效应降低血脂质的氧化预防心血管疾病抗菌食品中的毒菌，蛀牙菌，植物病原菌等抗病毒流行性感冒病毒，烟草花叶病毒抑制酵素活性血管紧张素1转移酵素，齿垢合成酵素抗突变抑制基因突变，抑制染色体异常抗肿瘤作用抑制肿瘤增值，降低肿瘤数目，降低肿瘤容积抑制以發癌剂诱导肿瘤发生抑制病毒性肿瘤发生，促进肿瘤细胞的程式化死亡抑制肿瘤细胞的增生，抑制肿瘤转移消臭消除口臭，鱼腥臭，粪便臭改善肠道菌相整肠提高肠道乳酸菌及比菲德式菌含量及比例，降低肠道无益菌及有害菌含量与果寡糖肠道菌相相乘作用其他还包括：抗过敏，防止紫外线伤害，防止放射线伤害，抑制血胆固醇，血脂质的增加，抑制血糖上升，抑制血压上升，预防龋齿，以及减肥儿茶素类物质具有高度的抗氧化活性，对于血球抗脂质过氧化效应相当明显。其抗氧化能力乃与儿茶素或没食子酸为主的高亲水性物质及非极性的物质等可以催化活性氧（ROS）形成酵素的活性，螯合会导致自由基形成的亚铁等离子，或直接与ROS反应而将其清除的结果。上述这些能力，可有效的抑制生物分子（包括脂质，蛋白质和核酸等）的氧化作用，并增强免疫力，预防相关疾病，延缓衰老及瘦身等保健功效。4. 儿茶素的制备儿茶素的制备大致上可以分为萃取和纯化两个程序，萃取是利用水，乙酸乙酯，丁酸乙酯为有机溶剂将儿茶素从茶中萃取出来。然后以聚酰胺粉末和木屑的吸附纯化儿茶素。这两步经由高效液相层析法进行分析比较得最好的萃取和纯化的试剂。4.1萃取液的制备 先将各茶叶如绿茶等磨成粉末状，然后取茶粉5mg，加入80度的热水1ml于水浴中，萃取三十分钟。4.2 HPLC层析方法的建立 本实验进行的设备包括泵，界面，光二级阵列侦测器。在常温下将样品分离，配合侦测器以280或220nm吸光值的变化进行检测与分析。因为本实验要分析茶中的成分以及最后得到的物质的量，因此使用20ul的loop，注射样品量为20ul，移动相使用甲醇-醋酸，首先，以甲醇开始并缓升至30%，接着再缓升至50%，最后冲提之80%的甲醇，整个程序为36分钟。应用于抗氧化物质的检测的HPLC，使用1ul的loop，移动相为使用水-甲醇，梯度冲提系统先以15-30%甲醇开始，然后以甲醇开始并缓升至45%接着再缓升至50%，最后冲提之80%的甲醇，整个程序为30分钟。4.3萃取 水-烷基乙酯分配萃取 先取10mg绿茶粉以50%甲醇500ul于温室震荡萃取30分钟，当以对照组。另取10mg绿茶粉，先以纯水500ul湿润，或直接加有机溶剂乙酸乙酯或丁酸乙酯500 ul，在室温下震荡萃取40分钟，经14000rpm离心10分钟，可得有基层和水层。所得到的有基层再以100ul纯水10分钟，经14000rpm离心10分钟，进行两次。将所得到的有机溶剂进行真空干燥后，回溶于50%甲醇，经离心后直接进行HPLC，以分析其中的酯化型儿茶素和咖啡因的组成成分的变化。之后与本实验已建立的儿茶素类的标准品的HPLC层析图谱各成分的吸光光谱，波峰面积，换算出酯化型儿茶素物质的回收率。利用SephedexLH-20胶体管柱进行茶叶萃，液体预分离，经HPLC二次分离后，分别收取不同时间点的流动相，借冷冻干燥得到单一的儿茶素及酯化型儿茶素类物质。HPLC使用的移动相及分析条件如下：A液（2.5%醋酸的水溶液）与B液（100%甲醇）的混合液由开始的89：11增至70：30进行20分钟的冲提，再由70：30增至50：50冲提至25分钟，再由50：50增至20：80冲提至30分钟，再以20：80冲提35分钟，最后再回到开始的比例平衡管柱20分钟，流速为1.2ML每分钟结论：由HPLC的紫外检测可得到分离的有基层中包含五种成分，并且从两张图谱的波峰的面积可得乙酸乙酯萃取的量高于以丁酸乙酯所萃取的量。高于以丁酸乙酯所萃取的量。萃取图样4.4纯化木屑的吸附及冲提：取30mg木屑加入500ul绿茶粉的热水萃取液，进行吸附，吸附后经14000rmp离心10分钟可得未被吸附茶萃取液屑及吸附后木屑。吸附后木屑分别以500ul纯水洗涤三次，以60%乙醇80%乙醇分别冲提一次即可。聚酰胺粉末吸附及冲提：取5mg聚酰胺粉末，加入500ul绿茶粉的热水萃取液，进行吸附，吸附后经14000rmp离心10分钟可得未被吸附茶萃取液屑及吸附后聚酰胺粉末。吸附后聚酰胺粉末分别以500ul纯水洗涤一次，再分别80%乙醇分别冲提两次即可。结论:从HPLC 紫外图谱中可得聚酰胺的波峰面积大于木屑的面积，可得聚酰胺的吸附效果比木屑的吸附效果要好。纯化图样5.儿茶素部分功效的检测5.1儿茶素抗氧化能力的检测：抗氧化物质清楚自由基的作用是由抗氧化物质提供氢离子给自由基，使自由基连锁反应中止，让自由基转变为安定状态，失去攻击分子的能力，而抗氧化物质本身则会形成稳定的氧化性分子;儿茶素类这一类的抗氧化剂。DPPH为一种稳定的自由基，在乙醇溶液中呈现蓝紫色。被常用作抗氧化指标的试验试剂。当DPPH自由基被清除时，所呈现的颜色会由蓝紫色蜕变为淡黄色；脱色程度越高，则表示DPPH自由基被清除的程度越彻底。DPPH自由基的甲醇溶液在517nm波长下有最强的吸收。因此可借由517nm吸光值的减少来代表DPPH自由基被清除的程度。测定方法是在微量离心管中先加入400ul不同浓度的Trolox标准品溶液，之后迅速加入400ulDPPH甲醇溶液（0.2mM），使最后体积成为800ul.均匀混合后于室温下避光静置90分钟，而后以分光光度计检测517nm吸光值。另外将各组冻干粉末样品取1mg溶于1ML的5%甲醇水溶液中，以同样的方法与DPPH试剂反应后测其吸光值。然后与标准品对照。结果：由100%或50%甲醇浓度配制的DPPH试剂，两者之间的差异不大，由标准线的精确度可得该试剂可清除自由基。5.2TEAC活性分析 TEAC为总抗氧化能力的检测。首先配制7mm的ABTS溶液，再加入过硫酸钾混合均匀，在常温避光下进行反应16小时，使之产生稳定的蓝绿色ABTS+自由基水溶液，最后以水将溶液稀释成630nm。然后以ELISA检测仪测其吸光值。结果：从图中可得，当甲醇浓度越高时，A630值会变差，但以水稀释时，彼此之间的差异并不明显。结论：TEAC 法由于灵敏度比较高反应快，不仅可以用于批次分析，更有可能设计成管柱后直接进行抗氧化活性程序的检测。抗氧化能力的图样6.儿茶素类物质的来源及应用 儿茶素类物质大量存在于茶叶中。发酵是茶叶加工的主要过程，其意义是指茶叶在制造过程中，茶叶的成分_儿茶素类被氧化的比例。一般茶叶含约15-35%的茶多酚类，儿茶素类物质含约10-25%，即约占茶多酚总量70-80%左右。而幼嫩叶的儿茶素含量相对较高，粗老叶则较低；另外，大叶种(如阿萨姆茶) 含量会较小叶种(如山茶属)高。对于儿茶素类物质在茶中的含量，是随茶的品种，产地，生长条件加工处理条件等因素而有所差异。一般来说，绿茶等未发酵茶所含的儿茶素高于轻度发酵茶（如清茶，乌龙茶）高于全发酵茶（如红茶）。 鉴于儿茶素类物质的众多保健功效及显著的抗氧化能力，其在生活中有多方面的应用。应用对象 作用 饮料及一般食品清凉饮料防止氧化，抗菌，保持香气，增加口感，提高附加价值肉制品防止氧化，消臭，防止变色糖果口香糖防止氧化，抗菌，增加风味，防止龋齿糕饼类防止氧化，抗菌，增加风味咸干鱼防止氧化，保持鲜度，防止变色食用油鱼油防止氧化，消除臭味 保健食品胶囊，锭剂防止氧化，抗菌，抗病毒整肠健康饮料消除活性氧，自由基等饲料动物饲料添加剂改善动物肠道菌相，促进动物健康鸡饲料添加剂降低蛋中脂肪及胆固醇含量，低胆固醇鸡蛋 化妆品乳霜面膜防止皮肤过氧化，抑菌消臭药剂儿茶素类药剂试药高纯度儿茶素药品药品目前文献资料建议每人（成人）每日的儿茶素摄取量为1-2克，由于儿茶素是非常强的天然抗氧化剂，在低剂量（20-500ppm）下既有很好的抗氧化效果，因此其添加量并不需要太高。7.致谢词 感谢学校给了我这次机会，能够来到嘉南药理科技大学，同时也得感谢这个学校，它提供了我们太多的资源，在图书馆可看到各式各样的图书，对于儿茶素能有各方面的了解，也提供给我一个能静下来好好读书的环境。 这里也感谢我的同学，我的舍友，她们把论文的内容及格式准确的告诉我，让在外读书的我得到信息。并且她们在忙碌的生活中不忘提醒我们要交作业。