藻类生物学实验室新生培训手册.doc

藻类光生物学实验室新生培训手册欢迎各位新生来到藻类光生物学实验室，在这里你们将度过你们的研究生生涯。为了使你们尽快融入实验室这个大家庭，为了使你们今后能够更好的进行科学研究，本实验室将对所有来到这里的新生进行为期2周的培训，希望大家能够积极参与，enjoy it！【培训内容】了解实验室规章制度及研究生须知掌握基本实验技术培训总结一 了解实验室规章制度及研究生须知 为了使实验室能够高效、有序的运转，藻类光生物学实验室制定了自己实验室的规章制度，每位在这个实验室学习工作的人员都必须遵守这些规章制度，同时，各位研究生还需要遵守研究生守则，以保证自己能够顺利毕业。 培训方式：抄写并熟知相关规则。 培训时间：入学第一周第一天二 掌握基本实验技术 为了能够进行科学研究，一些基本实验技术的掌握是必须的，新生将在实验室技术人员的指导下对实验技术进行熟练操作、掌握。以下是藻类光生物学实验室必须掌握的实验技术，新生在进行实际操作前，必须先对实验原理及步骤进行预习。 培训时间：开学第一、二周1. 海水二氧化碳系统各分量的计算：气态CO2溶入海水后，一方面服从亨利定律（在一定温度下，气体在液体中的饱和浓度与液面上该气体的平衡分压成正比）：CO2(g)CO2(aq)，因此CO2的平衡溶解度CO2与CO2的平衡分压pCO2之间的线性关系可表示为CO2(aq)= KH*pCO2，KH是海水中二氧化碳的溶解度系数与温度、盐度和压力有关;另一方面，CO2还和水反应生成碳酸，CO2H2O H2CO3，然后，H2CO3分两步电离H2CO3K1 H+ HCO3-K2 CO32- 2H+K1= aH+HCO3-/H2CO3 （1）K2= aH+CO32-/HCO3- （2）K1、K2、分别是碳酸的第1、第2表观解离常数, 其中HCO3 +2 CO32-=Ac （3）Ac为碳酸盐总碱度,它跟海水总碱度(AT )有如下关系：Ac=AT - 2.206 10-5 Cl KB/（KB + aH+） = AT BCl是海水氯度，KB 是硼酸的解离常数当海水温度、盐度确定时，KH、K1、 K2、 B值都可查表得到，这样通过测定海水的pH 和总碱度，按下列方程即可计算碳酸盐体系各组分(HCO3-、CO32-、CO2*、CO2)的浓度和pCO2。由公式（1）（2）和（3）可得碳酸系统各组分计算公式：HCO3-=Ac/(1+ 2K2/aH+)CO32-Ac(K2/aH+)/(1+2K2/aH+)CO2*= (AcaH+/K1 )/(1+ 2 K2/ aH+)CO2HCO3 + CO3 + CO2*=Ac(1+K2/ aH+ aH+/K1)/(1+ 2 K2/ aH+)pCO2= CO2*/KH因为海水中CO2(aq)和H2CO3是无法区分的，所以用CO2*表示两者的总和，以上各参数计算在软件CO2 SYS 完成 (By：Lewis, E., and D. W. R. Wallace. 1998. Program Developed for CO2 System Calculations. ORNL/CDIAC-105. Carbon Dioxide Information Analysis Center, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy, Oak Ridge, Tennessee.)。计算题：当温度是10时，pH值为8.3的海水总碱度为2.510-3mol/L, 盐度是31， 查表得B值为810-5mol/L，CO2溶解系数为4.62110-2mol/L/atm, pK1和pK2分别是5.98和9.10，求海水中各种DIC组分的含量。2 细胞色素的定量2.1叶绿素a（chla）、叶绿素c（chlc）和类胡萝卜素【实验原理】根据chla甲醇提取液在665nm处有最大吸收峰，利用分光光度计法测定chla的含量。【实验步骤】1）将藻体置于一定量的甲醇中，放置于4的冰箱内过夜处理。2）1500g离心10min，取上清，用分光光度计测定其在750、665、652的OD值。3）按照Porra提供的公式, Chla (g/ml)=16.29*（A665A750）8.54*（A652A750），计算其含量。采用Jeffrey& Haxo的公式计算chlc含量：chlc(g/ml)=67.3A635-14.1A668A635和A668代表波长为635和668的吸收值。 采用Strickland & Parsons的公式计算类胡萝卜素含量：Carotenoids(g/ml)=7.6*(A480A750）-1.49*(A510A750) 2.2藻红（PE）和藻蓝蛋白（PC）1）取约为0.2g的藻体，在研钵内加入一定量的石英砂和少量的磷酸缓冲液（pH6.8）将藻体研碎，2）加约10ml的磷酸缓冲液10000r/min离心10分钟，取上清液，将沉淀物继续研磨，并重复上面的步骤，3）最后将溶液定容为25ml，然后用分光光度计测定A455、A564、A592 、A618 和A645值。PE和PC的含量按下列公式计算：PE= (A564-A592)-(A455-A592)* 0.2/0.12 PC= (A618-A645)-(A592-A645)* 0.51/0.15注意事项：1.藻体研磨要尽量充分，直至离心沉淀物基本无颜色。计算题：已知培养液中藻体的浓度是105cells/ml, 取10ml培养液，离心，用5ml甲醇过夜处理后，离心取上清，测得其在750、665、652的OD值分别是0.001、0.0082、0.0026，求单位细胞藻体中叶绿素含量。问答题： 1. 为什么在测定叶绿素定量或扫描吸收光谱时，通常需要测定750nm的吸光值？2. 色素定量的公式较多，采用不同计算公式，验证差别的大小。3. 色素的提取，是定量的关键， 如何确定提取是完全的？ 对于组织结构负责的藻体，需将其研磨碎后提取， 应注意那些步骤？3.光合作用速率的测定3.1 C14测定方法【实验原理】浮游植物光合固碳速率（初级生产力）依照Steeman Nielsen（1952）发明的14C同位素标记法来进行测定。浮游植物进行光合作用需要固定海水中的无机碳（DIC），海水中碳元素是以HCO3- 、CO32-、CO2和H2CO3等形式存在，它们之间存在动态平衡，可以相互转化，这样当加入H14CO3-时，经过培养之后，通过液闪计数可以计算浮游植物固定了多少14C，再乘以溶液中DIC和H14CO3-的比例，可以推算浮游植物总共固定了多少DIC。【实验步骤】1）进行光合固碳速率测定时，将取得的水样用180m孔径的筛绢滤去浮游动物，分装到体积为20ml的石英管中。2）然后用连续加样器（eppendorf）吸取一定体积的14C液体，按每管100l（放射活度为5Ci）的加样量加入，盖上塞子摇匀后到室外接受阳光照射（或在太阳模拟器下）。3）石英管盖上或包裹上不同的膜以接受不同的阳光辐射处理，膜的类型因实验目的的不同而不同，培养过程中用流水水浴控温（当以模拟器为光源时，用空调控温），范围为2，培养时间一般至少4小时。4）培养完毕后将石英管拿回实验室内，每个石英管中的水样过滤到一张GF/F直径为25mm的玻璃纤维滤膜上，然后放入20ml的液闪瓶中。5）最后将液闪瓶连同滤膜一起放入到一个密闭的塑料盒中，同时在盒中放一小瓶约15ml的浓盐酸过夜，利用浓盐酸形成的酸雾将滤膜上未被浮游植物利用的无机14C（即NaH14CO3）转化为气体形式去除。6）第二天将液闪瓶取出放入45烘箱中烘干，储存。7）每个液闪瓶中加入闪烁液（Optiphase Hisafe 3）3ml。8）放置2-3h后，置于液体闪烁计数仪（Scintillation Counter, BeckmanCoulter, LS6500）中测定。浮游植物固碳量用下列公式计算： gC/L = (CPML-CPMD)/Ce IfDIC/ACPML为接受阳光辐射处理样品中被固定的放射性物质的放射量（每分钟计数的数目）；CPMD为对照样品（暗瓶）中被固定的放射性物质的放射量；Ce为计数效率，液闪计数仪的计数效率通过测定14C的标准样品获得；If为同位素差别因子，在CO2的固定过程中，细胞对14C和12C的利用率存在差异，12C与14C相比，其同化率快6%，故If为1.06；DIC为培养液总溶解无机碳浓度；A为所加14C的每分钟裂变数（DPM）（等于所加14C 活度（Ci）2.2106）；固碳速率(g C(g chl a)-1h-1)由该固碳量除以叶绿素浓度及培养时间得到。【注意事项】：1）由于NaH14CO3在溶液中是一个平衡体系，所以样品尽量保存在低温下(4oC)以防止溶液中CO2气体挥发，污染环境并影响测定结果。2）使用C-14进行实验操作时尽量远离，尽量少呆在有污染的空间内，并保持操作空间通风良好，以尽量减少呼吸吸入造成内辐射。3）样品处理是关键，否则会影响实验结果，甚至看到的实验现象为假象。得到的样品酸化一定要充分(酸不能重复使用，一般2-3次就要更换；酸化时间足够，一般酸化过夜)；野外实验时，酸化后样品一般要烘干(或-20oC)保存，烘干温度不能超过60oC(50-60oC)，烘干时间6h。样品带回实验室测定时，加入闪烁液后最好放置2-3h后测定，以便使样品充分消化，然后再进行计数。4）加入C14的量与叶绿素浓度的关系（参考数值）：5 g chla/L 加1Ci5）14C（Amersham bioscience UK Limited），为NaH14CO3浓缩液（12.5ml, 总活度25mCi即2mCi/ml），使用前稀释到50Ci/ml。具体操作为：先用普通滤纸预先过滤一定体积的海水，再用直径50mm孔径0.47m的微孔滤膜反复过滤。为防止在接下来的灭菌过程中海水发生结晶，加蒸馏水将其稀释到80%，然后用此80%的海水将NaH14CO3浓缩液稀释， 115下灭菌20分钟，保存于4冰箱中备用。计算题：在20ml海水中加入5Ci C-14，培养6小时后，过滤、酸化、烘干、加入液闪计数，到得的数值是CPML是9754.4，CPMD是1034.8，已知液闪计数仪的计数效率为0.96，海水中叶绿素浓度为0.32g/L, DIC浓度为2.2mM，求海水中浮游植物的固碳速率(g C(g chl a)-1h-1)。3.2氧电极法 （开放系统法，封闭系统法，原理与测CO2一样， 见下）测定一段时间反应槽中溶解氧浓度的变化，根据溶解氧浓度的变化、引起变化所需要的时间以及反应槽的容积可以计算光合作用速率。【注意事项】1） 需要保持温度的恒定，并进行搅拌。2） 通常测定是在封闭系统中完成的，因此反应容器中溶解氧的浓度随反应时间的延长而增大，考虑到氧气对光合作用的阻碍作用，需要按时用氮气充气，使得反应液中溶解氧的浓度不超过30%，反应器中细胞浓度不能过高。3） 大型海藻的光合作用应该采用开放系统的流水测定法，以消除“瓶效应”。3.2.1 P-C curve测定1）将细胞悬浮于无碳海水中后，取一定体积量注入反应容器，在400molm-2s-1光强下，使细胞进行光合作用2） 当细胞体内的“CO2”耗竭（净放氧速率为零）之后，添加NaHCO3溶液，在各种“CO2”浓度下测定藻类的光合作用速度。Km（DIC或CO2）根据Michaelis-Menten方程拟合求得：V=Vm*S/(Km+S)V：给定无机碳浓度下的净光合放氧速率Vm：饱和无机碳浓度下的净光合放氧速率S：DIC或CO2浓度Km：达到最大光合速率（Vm）一半时的无机碳（DIC或CO2）浓度注意事项1）无CO2缓冲液的配制不当或藻类材料的清洗不完全，都会使得藻类光合放氧达到零所需的时间拉长。这种情况下，细胞在强光照和低CO2浓度下容易受损伤，导致光合作用活性降低;同时也会增加细胞对低CO2浓度的适应性，影响光合作用对CO2亲和程度的判断。使细胞内“CO2”耗竭所需的时间一般不能超过30 min。如果超过30 min,应该重新配制无CO2缓冲液和实验材料。2）测定条件的确定 除了CO2以外影响光合作用速度的主要因子有光照强度、光质、温度、溶解氧浓度及水流等。因此，在测定某种藻类光合作用与CO2浓度关系之前.首先需要确定光合作用速度饱和时的光照强度，然后在此光照条件下确定其最适温度。在测定过程中，必须保持光照与温度条件的恒定，进行搅拌，在短时间内完成测定。通常测定是在封闭系统中进行的，因此反应容器中的溶解氧浓度随着时间延长而增大。为了获得具有可重复性、可靠的数据，考虑到氧气对光合作用的阻碍作用，需要按时用氮气充气，使得反应液中的溶解氧浓度不超过30%。大型藻类的光合作用可以采用开放系统的流水测定法川。用此方法进行光合作用测定时，新鲜的海水不断地流过藻体，不易发生“瓶效应”(封闭系统测定时氧浓度增高、无机碳浓度降低等导致光合作用低下的现象)。3）无CO2缓冲液(反应液)的配制通常将具有缓冲作用的培养液作为光合作用测定时的反应液。如果测定能在短时间内完成的话，只用缓冲液作为反应液也可以。无CO2（CO2-free）缓冲液在调配各种CO2浓度反应液时是必需的。测定海产藻类时用低浓度的盐酸将海水处理到酸性(pH0）时的荧光产量。Fo 在光适应状态下当PSII的所有反应中心处于开放状态（qp=1）并且所有的非光化学过程处于最优时（qn0）时的荧光产量。Fv/Fm是PSII的最大光化学量子产量，又叫原初光化学的最大产量、PSII光化学反应的潜在产量、PSII潜在最大量子产量等，它反映的是当所有PSII反应中心均处于开放状态时的量子产量。当藻类或植物受到胁迫时，Fv/Fm显著下降。因此，Fv/Fm是研究光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。Fv/Fm是PSII光化学的有效量子产量，代表激发能被开放的反应中心捕获的效率，它定量了由于热耗散的竞争作用而导致PSII的光化学被限制的程度。由于在光适应状态下非光化学过程的到活化，因此Fv/Fm往往小于Fv/Fm任何使荧光从其最大值下降的过程均可称之为荧光淬灭，荧光淬灭程度一般用淬灭系数q（0q1）来表示。叶绿素荧光淬灭一般分为光化学淬灭（qn）和非光化学淬灭（qn或NPQ）6.1 Xe-PAM操作步骤：1.在电脑上双击Wincont软件进入操作界面；2.将样品加入样品池，放入样品槽，根据Ft值（300-500）设置PAM-gain，取出样品池（或样品池中加入参比液，如培养基滤液等）点击Auto-zero，实验过程中无论改动什么参数，测量前都需自动调零，根据需要在设置窗内设置相应参数（可以保存以便下次使用）；3.暗适应样品要想获得Fv/Fm，需要点击界面右侧参数区Fm按钮，然后点击SAT-Pulse按钮获得相应Yield值；4.同样在Light curve，Induced curve界面获得相应曲线。6.2GFS-3000F操作步骤：1) 使用前需对分析器进行校准：需联机对仪器进行校准，参阅说明书。当|dCO2|2ppm 时需对CO2 进行校对零点；当|dH2O|200ppm 时需对H2O 进行零点校对。如果使用频率较多的话，一般每隔1-2 周需进行零点校准，可每隔3-5 个月进行CO2 和H2Ospan（最大值） 校准。2) 连接仪器。连接叶室和主机，连接时注意From 和To 管的连接。连接进气管和电源。3) 关闭叶室，开机。在菜单系统（System）下选择打开测量模式（Measure mode on），然后选择标准测量头（Standard head）或荧光附件（LED-Arry/PAM- Module3055-FL）。在测量模式（Measure mode）下预热3060 分钟。4) 在菜单设置下进行文件名和参数的设定。首先设定文件名（File name）。然后设定流速（Flow），流速的范围600900，气体交换强度较小时流速值可设定低一些，标准设定为750。设定流速之后，可设定CO2 和H2O 的浓度。若利用环境大气，不需控制CO2浓度，则不必设定，而且须将CO2 吸收管换为空管；控制CO2 浓度需先将CO2 吸收管换上，同时安装好CO2 注入系统（小钢瓶）；取消CO2 设定操作：选择CO2，选OFF即可，未设定前显示未CO2off。设定叶室风扇的速度，一般设为5 即可。之后可以设定叶室温度和光强。设定光强模式（Light Mode），有三种选择：外界光强PARamb，叶片上部PARtop，叶片下部PARbottom，通常选择PARtop，然后按light 设定光强。选择叶室温度控制模式(Temp mode)：有三种选择：叶片温度Tleaf，叶室温度Tcuv，跟随外界温度Follow ambient Temp, 选择时输入各模式前的数字即可并接着设定相应温度。按翻页,设定荧光参数，夹上无荧光的薄片进行调零Zoffset; 夹上暗适应后的叶片后调节测量光强度MLAmpl 及Gain 使得瞬时荧光值Ft 在200300 之间；其它参数为默认设定值即可。不测定初始荧光Fo 和Fm 时无需设定。5) 将叶室关闭严实，观测主机前面的样品室和参比室的气流指示器显示的流量是否相等，在确认叶室已密闭但两个指示器的流量仍不相等，则需使用电脑联机校准气流直至流量相等（参考）。按窗口下部的测量模式Mode MP 即选为调零模式Mode ZP，在此模式下进行调零，约30min，选Windows 中的2charts，查看查看dCO2Z