红瘰疣螈形态结构与生存的实验研究___省级_段登武.doc

云南省大学生创新创业训练计划项目立项申请表推 荐 学 校： 玉溪师范学院项目名称： 红瘰疣螈形态结构与生存的实验研究项目 申报 类别： 创新训练所属一级学科名称： 生物学申请人： 段登武所在学院及年级： 资源环境学院 09级生物科学指导教师： 李红梅 单位和职称： 玉溪师范学院资源环境学院 副教授填表日期： 2012年4月18日云南省教育厅高等教育处制2012年2月一、项目申请人情况 申请人姓名段登武性别男民族汉出生日期1989.10.15所在学院资源环境学院专业、班级生物科学 2009级项目名称红瘰疣螈形态结构与生存的实验研究通讯地址云南省玉溪师范学院电目类别 创新训练 o 创业训练 o 创业实践项目周期2012年3月-2013年3月所属学科专业生物科学申请人参加科研的经历自何年月至何年月参加的项目担任的工作20102011玉溪市白鹭栖息地及种群结构调查参与项目组其他成员（不超过5人，不包括申请人和指导教师）姓名性别年级所在学院专业分工签名王啟能男2009级玉溪师范学院生物科学标本采集、解剖观察王啟能彭东燕女2011级玉溪师范学院生物科学资料查询、骨骼标本制作彭东燕肖小柳女2011级玉溪师范学院生物科学组织切片制作、记录肖小柳（一）项目介绍（研究目标、研究背景及现状、工作原理和方案设想、计划进度安排等）目标:1、通过对红瘰疣螈的外形及内部结构和组织研究观察，了解其结构特征，认识其适应环境生活的特有组织特性，为人们对其的保护提供科学理论依据；2、通过对其外形及内部结构的观察研究，可为红瘰疣螈的室内人工养殖提供一定的科学依据，进而达到红瘰疣螈的保护目的。背景及现状：1.概述生物学特征红瘰疣螈属于两栖纲（Amphibia）有尾目（Caudata）蝾螈科（Salamandridae）疣螈属（Tylototriton）的代表动物之一，雄螈全长136mm150mm，雌螈147mm170mm。头部平扁，两侧脊棱显著隆起，无唇褶，体两侧各有1排球形瘰粒1416粒。彼此分界明显。指4，趾5。尾较弱而侧扁，鳍褶较低。背面棕黑色；头部、四肢、尾部以及背脊棱和瘰疣部位均为棕红色或棕黄色。捕食蚯蚓、蜈蚣、步行虫、蜗牛等为食。数量也较多，但其去内脏的干制品称“蛤蚧”被捕捉；又以其色斑艳丽，活体也被出售供饲养观赏，数量急剧减少。随着人口增长及科技的进步，人们对环境的污染也越来越严重，大事开发山区，其栖息环境日益缩小，也影响其数量，亟需加以保护。红瘰疣螈一般生活于海拔9002 000m高的山区潮湿地区或水塘中，雨季常在田边地角，乃至菜地沟槽、菜地埂子草丛均可见到。有时23只，也有45只成小群活动寻食。每年57月为繁殖期，这时漫湾地区正处在雨季，山涧的积水塘、稻田水中是它们交配产卵、孵化场所。9月25日10月1日已见到较多的幼螈，体全长约7885mm，已接近成体，体背瘰疣已明显形成，色彩也近于成体，但不如成体鲜艳。地位 （1）中国物种红色名录评估等级： 近危 NT 几近符合易危 VU ；依据标准：由于该种在中国出现范围仅20,000 km2，分布区分裂，栖息地的面积和质量持续下降，过度捕获使得该物种接近“濒危”等级，因此被列为“近危”等级； （2）红瘰疣螈是我国级保护动物， 在中国红皮书等级上：属于需予关注 （中国红皮书等级生效年代：1996）。2.地理分布我国分布：红瘰疣螈是我国的特有种, 或主产于我国；在我国主要布于云贵高原和四川、重庆、甘肃、湖南、安徽、广西、海南。二、拟申报项目情况云南分布：在云南主要分布于中部、西部和南部。新平水塘，嘎洒，耀南也是其主要栖息地。最主要产于云南西南部丽江、泸水、盈江、保山、腾冲、龙陵、陇川、永德、云县、凤庆、南涧、双柏、新平、建水、绿春、景东共16县。显然，它在云南的分布也仅是少数县，占云南129县、市的12.4。3.研究现状主要涉及到的研究方向：红瘰疣螈皮肤的显微结构的观察；红瘰疣螈的繁殖生态；红瘰疣螈胚胎发育的初步观察；从线粒体Cyt b基因探讨红瘰疣螈物种地位的有效性红瘰疣螈的体温调节等；因此，本次研究是一个相对新颖的研究项目，对于红瘰疣螈这方面的研究尚未涉及，故很具有研究价值。工作原理和方案设想：工作原理：以形态结构解剖观察为出发点，对红瘰疣螈进行进一步的了解，观察其内部形态结构特征，了解其对环境的需要，制作各结构组织切片，对各结构进行组织切片观察，进而全方位的对红瘰疣螈进行观察了解，最终达到目标要求为红瘰疣螈的保护措施的制订提供科学的理论依据。通过现象了解本质，通过观察红瘰疣螈的形态结构及各结构的组织特点，了解红瘰疣螈的特有特征与对环境的适应特性，从而在在红瘰疣螈采取保护措施时有一定的科学理论依据。石蜡切片法是玻片标本制作的一种常用方法 ,此法的主要优点是切片薄而均匀 ,并且切片可以连续不断 ,有些不能用徒手切片的柔软材料 ,用石蜡包埋切片 ,效果很好。操作步骤具较强的可操作性。透明骨骼标本是利用化学药品和染料，对动物体的肌肉和骨骼进行固定、染色，再把肌肉上的颜色退去，以保留骨骼上的颜色，借助药品的作用，促使肌肉透明，使被埋藏在肌肉中染有颜色的骨骼显现出来。适用于小型脊推动物和幼体。透明骨骼标本的制作过程，主要有：剥皮去内脏、材料的固定、透明、染色、脱色、脱水、保存等步骤。初步了解可能致危因素：生境退化或丧失（人为所致）农业作物小农耕作； 生境退化或丧失（人为所致）基本建设居民安置 ；采捕药物维持生计或本地贸易 ；采捕药物国内贸易； 采捕文化、科研或休闲活动国际贸易。方案设想：【一】总体研究实施方案 【二】本研究分以下几项工作1、组织切片及解剖技术培训学习 一方面以小组的形式进行培训，老师传授指导学习，掌握解剖及标本制作的操作技巧；另一方面查阅相关资料学习；2、红瘰疣螈活体标本采集为了能更具体的观察到不同时期红瘰疣螈的形态结构特征，所以采集大可分为三个阶段：第一阶段采集时间：2012年46月（生殖前期）第二阶段采集时间：2012年68月（生殖期）第三阶段采集时间：2012年810月（生殖后期）采集方式：（1）通过当地居民帮忙采集； （2）通过护林员帮忙采集； （3）到哀牢山等周边环境亲自采集。采集地点：新平水塘，耀南，嘎洒，哀牢山等自然保护区。（注1：采集时清晰记录采集地点、海拔及环境特征等等；注2：采集需要雨衣、电筒及采集箱等）3、养殖观察为了更方便的观察到红瘰疣螈对环境的适应特性，所以在把标本采集回来后，进行养殖观察。（需要饲养箱、饲料等）4、标本解剖观察（1）对标本进行解剖，观察记录（拍照）红瘰疣螈内部结构特征，如脑干剥离、神经系统、泌尿系统等观察，结合组织切片进行分析观察；（2）制作骨骼标本（透明骨骼），了解红瘰疣螈的骨骼结构特征，为红瘰疣螈的整体结构分析了解提供依据；（3）对内部各结构系统做组织切片观察，如神经系统、泌尿系统、呼吸系统及生殖系统等组织切片制作；（4）制作内部结构标本及结构组织切片，为后期的结论提供依据。器材和仪器：动物切片机，毛笔，载玻片，盖玻片，烤箱，显微镜，染色缸；组织切片制作步骤：(1）取材（神经系统组织、泌尿组织、呼吸组织及生殖组织）(2)固定(3)洗涤(4)脱水(5)透明(6)浸蜡(7)包埋(8)切片和附贴(9)烤片(10)染色(11)封固方法：1取材：动物处死后，快速取出所需的组织（消化组织、生殖组织、肺组织）。取材的刀要锋利，严禁用手或镊子挤压，以免损伤组织。切取的组织块厚度一般为0.51.0cm，大小1.52.0cm，以免影响固定效果。2固定：将组织投入10%的福尔马林、zenker氏等固定液中固定，固定液的量大约为组织的5倍。固定时间约为24h。3洗涤：流水缓慢冲洗，小组织可不冲洗，多次换水冲洗即可，一般为1024 h。4脱水：在有盖瓶子类进行，脱水一般采取上行梯度酒精，从70%酒精至95%酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久，容易发脆，一般约为4 h。5透明：先将组织放入纯酒精与二甲苯等量混合液中半小时至一小时处理，再将组织放入二甲苯中透明，一般1530 min，期间需要更换一次二甲苯，对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。6浸蜡：将透明后的组织放入熔化的石蜡内浸渍，浸蜡温度比比石蜡的熔高2，浸蜡时间为35 h，期间更换一次石蜡。7包埋、将熔化好的石蜡倒入包埋框，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，将准备好的标签放在待凝固的石蜡面上，冷却。完全凝固后，修整蜡块。8切片和附贴：冷冻组织蜡块，固定刀架、刀片和蜡块；切片：切片厚度：5 um；转速：4050次/min；展片；捞片、烫片；45；切片过程中，固定好蜡块、刀片，注意刀与蜡块的（5）。出现蜡片上卷、裂隙、刀痕等立即移动刀片和切片刀，转至刀刃锋利处。毛笔必须由下向上拨动，烫片时水温不宜过高。9烤片：将切片放在酒精灯烤片来回晃动。 10染色：二甲苯(10min) 二甲苯（5min）无水乙醇（1min）95%酒精 （1min） 85%酒精（1min）75%酒精（min）自来水洗（min）苏木精染液（10min）自来水洗（min）盐酸酒精（）自来水洗（0.5以上）伊红染液（0.51min）自来水洗（0.5min）酒精（min）酒精（1min）无水乙醇（2min）无水乙醇（2min）二甲苯（23min）二甲苯（23min）11封固：切片经染色透明后，取出切片，擦去多余二甲苯，滴一滴中性树胶，将盖玻片盖于切片上。贴上标签并注明名称，编号。试剂1：乙醇，乙醇，,乙醇，乙醇，乙醇，无水乙醇，二甲苯，石蜡，切片树胶，苏木精，伊红，苦味酸，；包埋框。场地：学校实验室；指导教师：有动物学知识，从事动物学实验教学及研究 透明骨骼制作步骤：(1)剥皮去内脏选取体形完整的小型脊推动物，麻醉后剥去皮肤，挖出内脏，清水冲洗干净，用线缚于玻璃板上。(2)材料的固定将材料浸入95% 酒精710 d，每两天换一次酒精。如材料已用510福尔马林保存过，需用清水漂洗后再浸入95酒精中，使其充分固定。然后用清水冲洗已固定材料。也可将材料浸入3重铬酸钾中12 d，更换溶液至不再混蚀为止，以除去材料表面的脏物和脂肪粒块。取出材料清水冲洗，浸入70酒精脱水，再浸入95酒精12 d。(3)透明将材料浸入1氢氧化钾中24 d，至肌肉呈半透明状并隐见其中的骨骼为止。(4)染色浸人茜素红酒精溶液（1 g茜素红溶于100 ml95酒精，搅拌呈黄褐色溶液。再与900 ml1氢氧化钾溶液混合，成为紫色染色液）染色1236 h，待全部骨骼染上深红色时取出。(5)脱色方法 ：将染色的材料浸入混合液（1份1氢氧化钾和1份5甘油）24 d，直到肌肉退成粉红色为止。取出材料放在强烈的阳光下晒，使肌肉褪色。或者在75ml水里加入20ml甘油和5ml氢氧化铵，将材料浸在里面漂白，使肌肉脱色透明。方法 ：将染色的材料浸入混合液（30ml、甘油30ml、水60ml）13天，放在强烈阳光下晒，使肌肉退成粉红以为止。浸人30甘油1天，再浸人混合液（氢氧化铵30ml、甘油30ml、水70ml）25天。方法（3）将染色的材料浸入95酒精610h，然后浸入l氢氧化钾中透明，再浸入34过氢化氢（双氧水）中脱色12d，随时视察，至肌肉上颜色基本脱掉时立即取出。(6)脱水经过脱色处理，肌肉已透明，骨骼呈紫红色。将材料浸入25甘油、50甘油、75甘油、纯甘油中每级24d。经过过氧化氢处理的材料，标本内会产生许多气泡，可用注射器具吸出。 (7)保存经过各级甘油脱水，直到标本透明，再换一次纯甘油并加入少量麝香草酚可长期保存。 试剂2：95酒精、510福尔马林、3重铬酸钾、1氢氧化钾、2氢氧化钾、5甘油、25甘油、30甘油、50甘油、75甘油、纯甘油、氢氧化铵、34过氢化氢、水。场地：学校实验室；指导教师：有动物学知识，从事动物学实验教学及研究。5、查阅资料分析特征（1）分工开展工作，查阅相关资料，分析总结特性，得出结论。(2)根据结论，写出相关研究论文，请老师指导，查找问题更改错误，写一篇研究报告。计划进度安排：（1）我们将在2012年3月2013年3月完成课题选择及实验方案制订。（2）2012年4月2012年5月完成实验设计方案；（3）2012年4月2012年6月完成红瘰疣螈的采集；（5）2012年5月2012年6月切片制作的小组学习；（6）2012年7月2012年10月解剖观察及组织切片制作观察；（7）2012年月进行数据统计，论文撰写，总结报告参加结题答辩和成果推广。（二）项目自我评价（创新点、实现的可能性、可操作性、可能存在的问题等）创新点:红瘰疣螈属于国家级保护动物，接近濒危动物，属于易危动物，目前国内为对其的研究还很少。通过对红瘰疣螈形态结构观察的实验研究，可以加深对其形态结构以及生活适应性的了解，为红瘰疣螈人工养殖条件下的繁殖提供理论依据，为保护红瘰疣螈作出贡献，也为其它濒危两栖类动物的保护提供参考资料。从形态结构解剖、内部结构标本制作及结合组织切片观察入手进行研究，对国家保护动物进行深入的了解研究。以对红瘰疣螈进一步保护为目的,为红瘰疣螈的保护提供理论前提，在将来的保护措施制订时有科学的理论可依。实现的可能性:学校实验室的条件也很充足，学校给予了很全面的实验条件，实验室具有完备的实验仪器；指导老师对于这方面的研究很熟悉，曾经进行过相关类型的研究，再有，指导老师的研究知识很全面；我们小组都为生物专业的学生，大家积极性很高，我们也有一定的经验关于调查研究，做过很多关于解剖学的实验。我们小组对动物保护的意识都很强，大家都很热衷于此类研究活动。可操作性 理论知识方面，我们都是生物专业的学生，大家对相关知识具有充分的了解；标本方面，在当地护林员及当地居民帮助下，能很快采集到大量的标本；实验室方面，学校实验室的条件准备很是充分，仪器等方面条件很充分；指导教师方面，老师曾经做过有关红瘰疣螈相关的研究，带这方面的研究知识很熟悉；团队方面，大家都是生物系的学生，对这方面的研究甚是感兴趣，具有很高的积极性。可能存在的问题:1.同学们在组织切片操作技术方面有一定的缺陷，但通过老师的指导培训学习后，会弥补其的不足；2.在采集标本的时候可能遇到一定的困难，因为红瘰疣螈都是生活在距学校较远的山里面，但是在当地居民和护林员的帮助下，也可以决绝在此方面的困难；3.关于组织切片这一研究，同学们相对涉及的不是很深，了解的知识也不是很具体，所以需要进行小组培训，坚信在老师的指导学习及进行相关资料查询学习后，大家可以做的很好，会掌握的很好；4.关于透明骨骼标本的制作方法及步骤，大家都不是了解很透彻，都只是进行过基础的学习及操作，但在老师的教授及查阅学习后，大家能很好的完成，并且很好的掌握相关操作技术；5.没有具体的前例为引导，在做实验时可能存在不足和误差。所以需要大家细心认真学习操作技术，耐得住安静的氛围长期呆在实验室做实验及查阅资料，努力坚持探索。在得出结论前，要求反复做实验，经过多次相同结论，再给出确切的科学的结论。（三）预期成果（成果的具体形式，如：申请专利、公开发表论文、制作科技实物（含软件程序）等，可以同时有多种成果形式）1.完成研究论文12篇，研究报告一篇；2.拍摄记录红瘰疣螈的解剖结构图；3.实验涉及的红螺疣螈相关结构组织切片若干； 4.红瘰疣螈的标本若干；5.为其它濒危两栖类动物的保护研究提供一定理论依据；6.红螺疣螈具有一定的药用价值通过对其内部结构的研究，可为红瘰疣螈的药用研究提供一定的科学依据；7.提高实验组成员实验创新能力、动手操作能力、查阅资料的能力及参加科学研究的热情；8.最终为红瘰疣螈形态结构实践知识为其保护措施的制订提供参考理论依据，进而更好的达到红瘰疣螈的保护。（四）参考文献1、李红梅,姚锦仙.红螺疣螈皮肤的显微结构观察J.动物学杂志,2010,45(6):35-40. 2、蒙绍权,李桂芬,黄鸿宣等.版纳鱼螈的骨骼系统.动物学杂志,2006,41(4):100106.3、赵艳艳，王丽文，梁传成等.爪鲵消化系统的解剖学和组织学初步研究.四川动物，2005，24（3）：290293.4、温业棠. 版纳鱼螈的消化系统和呼吸系统.见: 赵尔宓主编.从水到陆蛇蛙研究丛书之一.北京:中国林业出版社,1990,4345.5、吕九全,路纪琪,牛红星等.商城肥鲵消化道的解剖学观察.动物学杂志,2000,35(2): 1922.6、赵尔宓.中国濒危动物红皮书(两栖类和爬行类) . 北京:科学出版社,1998 ,2.7、姚艳红,蒲德永,王志坚等. 双团棘胸蛙消化道解剖学及组织学观察.西南大学学报(自然科学版),2007,29（4）:144149.8、岳兴建,张耀光,王志坚.中华蟾蜍消化道组织学及组织化学研究.西南师范大学学报(自然科学版), 2002, 27(3): 383389.9、江剑平,陈祖祺,黄浩等.虎纹蛙消化道解剖学观察.福建师范大学学报(自然科学版)，2002，18（4）：7795.10、游源瑛. 性激素对黑龙江林蛙性腺分化的影响. 动物学杂志. 1966.11、张修月;焦保卫;吴天利;金灿彪;王德寿. 南方鲶性腺分化的组织学观察. 动物学杂志. 2005三、指导教师简况及对申请人和申报项目的评价姓名李红梅性别女民族汉政治面貌共产党员年龄38最终学历研究生职务教师职称副教授专业动物学所在学院玉溪师范学院研究方向动物学通讯地址玉溪师范学院资源环境学院邮编653100电子信箱(e-mail)H当前从事的教学、研究工作简介：本人当前从事动物学理论知识及实验的教学，主持动物学本科课程建设。先后在各级刊物上公开发表论文40多篇。主持云南省科学技术厅项目“抚仙湖生态环境的两栖动物监测和预警初探”（项目编号：2006B0088M）、主持省教育厅科研项目课题1项、主持省教科研项目课题1项，校级项目1项；参与市科技局项目1项，参与完成校级项目2项，曾长期对红瘰疣螈进行过一定的研究，并在2010年发表相关论文，如红螺疣螈皮肤的显微结构观察等。对申请人的专业基础、工作态度、学风及研究能力的评价：该生曾由我带过一学年的动物学课程（包括动物学实验课程），在一年的学习中，该生对学习的态度很积极；在小组学习进行中，与队员配合很好，能够很好的完成实验学习内容，最终交出理想的实验成果。对申请课题的价值、研究方案的可行性、工作基础等方面的评价：该项目研究的选题独特，具有很强的实验操作技能，能很好的锻炼学生的操作能力和实验技能，正好弥补当代大学生实践动手能力方面的缺陷。 研究方