豆豉纤溶酶的功能及应用前景.pdf

中国酿造 2010 年 第 9 期 总第 222 期 血栓栓塞导致的心脑血管疾病是当前导致人类死亡 的主要原因之一 利用纤维蛋白溶解酶 纤溶酶 溶解血 栓 使血管再通的溶栓疗法是目前治疗这类疾病最为有效 的手段 自从日本学者SUMI H等 1 从纳豆中分离到具有 强烈纤溶活性的纳豆激酶 韩国学者KIM W等 2 从韩国传 统食品Chungkook Jang中分离到纤溶酶CK11 4 我国研究 人员在豆豉 酱油等传统大豆发酵食品中也分离出具有 纤溶活性的酶 3 其中分离自豆豉的纤溶酶因具有很强的 活性和很好的抗凝 溶栓作用 故命名为豆豉纤溶酶 也有 人称溶栓酶 豆豉激酶 豆豉纤溶酶作为从传统食品中 发现的一种潜在的新型溶栓药物 与传统的溶栓剂相 比 具有血栓溶解能力强 活性高 安全性好 不引起内出 血 在体内半衰期长 药效持久 分子量小 可以通过消化道 直接吸收等优点 而且应用微生物技术生产纤溶酶酶具有 周期短 产量高 工艺简单 成本低等特点 应用前景广阔 1 菌株的筛选 诱变与菌种鉴定 豆豉是我国传统发酵食品 向梅等 4 从豆豉中筛选出 产纤溶酶的高产菌株 经鉴定为芽孢杆菌属枯草杆菌群细 菌 彭勇等 5 从豆豉中分离出2株具有较强纤溶活性的枯 草杆菌DC 2和DC 4 基因和分子水平研究表明 DC 2菌 株与日本的纳豆杆菌同属一个菌群 而DC 4菌株属于分 解淀粉芽孢杆菌 即豆豉纤溶酶产生菌并非一种 从而在 特性上可能存在一定差异 为了提高菌株的产酶能力 目 前许多学者 6 7 采用紫外线 60Co 亚硝基呱 硫酸二乙酯等 物理和化学的方法对目标菌株进行诱变 2 发酵工艺 豆豉纤溶酶的发酵工艺有固态法和液态法 固体发 酵大都是在煮熟的大豆上接种菌种 经培养后提取纤溶 酶 黎金兰等 8 对固体发酵法生产豆豉纤溶酶的工艺进行 了优化 确定了菌株的最佳产酶条件 液体发酵的工艺则 是在液体培养基中接种菌种 经过发酵后提取纤溶酶 崔 堂兵等 9 对豆豉纤溶酶产生菌的液体发酵条件进行优化 生产纤溶酶的活力为2345U mL 3 酶的纯化 分子生物学和酶学特征 3 1 豆豉纤溶酶的分离纯化 酶的分离纯化可以采用过滤 离心 盐析 超滤 凝胶 过滤和层析分离等多种方法 王成涛等 10 采用凝胶层析法 得到电泳纯的纤溶酶Subtilisin FS33 齐海萍等 11 将淡豆豉 浸提液经过硫酸铵沉淀 CM Sepharose FF离子交换色谱 和Sephacryl S 200凝胶过滤等纯化步骤 得到豆豉纤溶酶 单体酶 3 2 豆豉纤溶酶的分子生物学 豆豉纤溶酶的功能及应用前景 孙月娥 王卫东 徐州工程学院 食品学院 江苏 徐州 221008 摘要 豆豉纤溶酶源于中国传统发酵食品豆豉 具有溶解血栓等功能 是一种可以作为潜在溶栓药物的纤维蛋白酶 对豆豉纤溶酶 的研究现状和应用前景进行综述 为开发新型溶栓药物指明了方向 关键词 豆豉纤溶酶 功能 应用前景 中图分类号 Q555文献标识码 A文章编号 0254 5071 2010 09 0025 03 Functions and application prospect of Douchi fibrinolytic enzyme SUN Yue e WANG Weidong College of Food Engineering Xuzhou Institute of Technology Xuzhou 221008 China Abstract Douchi fibrinolytic enzyme which has fibrinolytic activity and could be used as thrombolytic agent is isolated from Douchi a traditional Chinese soybean product Present research progress and application prospect of Douchi fibrinolytic enzyme were reviewed which would provide a promising direction of new thrombolytic medicine development Key words Douchi fibrinolytic enzyme function application prospect 收稿日期 2010 02 07 作者简介 孙月娥 1973 女 讲师 吉林图们人 研究方向为功能性食品 the quality and fibrinolytic activity of Korean traditional rice wine J J Korean Soc Food Sci Nutr 2003 32 7 1066 1070 28 JIN J KIM S Y JIN Q et al Diversity analysis of lactic acid bacteria in takju Koreanricewine J Microbiol Biotech 2008 18 10 1678 1682 29 DUNG N T P ROMBOUTS F M NOUT M J R Functionality of select ed strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters J Food Microbiol 2006 23 331 340 30 TSUYOSHI N FUDOU R YAMANAKA S et al Identification of yeast strains isolated from marcha in Sikkim a microbial starter for amylolytic fermentation J Food Microbiol 2005 99 135 146 31 JEYARAM K SINGH W M CAPECE A et al Molecular identifica tion of yeast species associated with Hamei A traditional starter used for rice wine production in Manipur India J Food Microbiol 2008 124 115 125 专论与综述25 2010 No 9 Serial No 222 China Brewing 彭勇等 12 利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4中扩 增出豆豉纤溶酶BA DFE基因 首次在分子水平上指出了 豆豉纤溶酶产生菌与纳豆杆菌的差异 从而证明了豆豉 纤溶酶与纳豆激酶不是同一种酶 WANG C等 13 通过对 Subtilisin FS33与其他纤溶酶N端氨基酸序列比对发现 Subtilisin FS33与已知的纳豆激酶 Subtilisin E等有较高的 同源性 但其在相对分子质量 底物特异性 酰胺活力等方 面表现出较大差异 ZHANG R H等 14 16 分别实现了豆豉纤 溶酶在大肠杆菌 枯草杆菌WB800和毕赤酵母中的高水平 表达 为利用基因工程提高酶产量提供了参考 天然豆豉 纤溶酶的热稳定性及酸稳定性较差 崔堂兵等 17 采用定点 突变技术提高豆豉纤溶酶的活性获得成功 3 3 豆豉纤溶酶的酶学特征 豆豉纤溶酶的酶学性质包括酶的分子量 等电点 稳 定性 最适反应温度和pH值 酶活性的激活剂和抑制剂 等 张炳文等 18 通过对中国传统细菌型豆豉溶栓酶酶学性 质的研究发现 此酶的最适作用温度为60 最适pH值为 7 8 添加蛋白胨 明胶可以提高酶的活性 高浓度的Cu2 Fe3 和Al3 对此酶有抑制作用 牟光庆等 19 测定豆豉纤溶 酶的分子量为35kDa 40 时酶活力最高 其纤溶活性可 被Mn2 Mg2 及Na2SO3激活 Ca2 及乙醇 明胶对酶活力具 有较强的抑制作用 NaCl浓度低于10 时酶活力基本保持 稳定 由此可见 不同学者得到的纤溶酶的分子量 最适 温度 激活剂 抑制剂等都有一定差异 可能是豆豉种类或 测定方法不同造成的 这也说明了豆豉中纤溶酶资源的多 样性和丰富性 4 豆豉纤溶酶的功能 4 1 溶栓作用及其机制 血栓是在血管原有病变的基础上由纤维蛋白与血液 中有形成分所组成的凝块状物 其的形成往往是遗传因 素和后天因素共同作用的结果 戒烟 戒酒 生活规律 积 极治疗原发病等可以预防血栓的形成 目前治疗血栓的有效药物包括抗凝药和溶栓药 抗 凝药旨在通过影响凝血过程的不同环节以防止血栓形 成 溶栓药物是对已经形成的血栓进行溶解 从作用机理 来讲 微生物来源的溶栓药物可分成2类 一类是纤溶酶原 激活剂 如链激酶 葡激酶 其作用原理是先将纤溶酶原 激活为纤溶酶 另一类是纤溶酶类物质 其作用一方面是 迅速降解纤维蛋白原成小分子产物 这些降解产物不能 参与血纤维网的形成过程 从而阻碍血栓形成 另一方面 是直接降解血块中构成血栓骨架的纤维蛋白 从而起到 溶栓作用 刘晓婷等 20 发现豆豉激酶对实验性小鼠体内血栓形 成具有明显的预防和抑制作用 高秀丽等 21 采用纤维蛋白 平板法和溶解血凝块试验法发现 贵州豆豉酶提取物具 有溶栓活性 其溶栓作用可以通过直接溶解纤维蛋白 也 可以通过激活血纤维蛋白溶酶原间接溶解纤维蛋白 刘 宇峰等 22 发现豆豉提取液对家兔静脉血凝块有显著的血 块溶解能力 此外 能显著缩短家兔静脉血的体外凝血时 间 王成涛等 23 通过动物血栓模型 发现豆豉纤溶酶Sub tilisin FS33在体内和体外均具有明显的降解血栓纤维蛋 白的能力 增强机体的纤溶活性 提高抗凝能力是其溶栓 作用的主要途径 4 2 预防高血脂 牟光庆等 24 对豆豉纤溶酶粗提液预防小鼠高血脂作 用进行了研究 结果表明 酶粗提液可以降低小鼠血清中 胆固醇和甘油三酯含量 提高高密度脂蛋白胆固醇的含 量 显著降低高血脂小鼠低密度脂蛋白胆固醇 从而降低 动脉硬化指数 豆豉纤溶酶降血脂的作用可能是因为该 酶中存在着某种具有生物活性的因子 促使机体合成更 多的高密度脂蛋白进入血清中 从而能够携带更多的胆 固醇进入肝脏中分解而被消除 使血脂降低 此外 豆豉 纤溶酶可以预防脂肪肝形成 甚至可以促进已有病变的 消退 具体的作用机制有待进一步研究 4 3 其他功能 孙月娥等 25 研究发现 豆豉纤溶酶生产菌发酵液对食 品中常见的致病菌大肠杆菌 Escherichia coli 和金黄色 葡萄球菌 Staphylococcus aureus 具有抑制作用 此外还 可以抑制脂肪的氧化 阚建全等 26 认为酱油 豆豉等大豆 发酵食品中由于美拉德反应而产生类黑精 类黑精具有 清除羟自由基的能力 对油脂的抗氧化以及抑制亚硝胺 合成的作用 宋永生等 27 认为大豆发酵后糖苷型大豆异黄 酮部分水解为游离型大豆异黄酮 从而提高了豆豉的抗 氧化性 5 前景展望 血栓栓塞性疾病严重危害着人类健康 溶栓疗法被 认为是治疗血栓性疾病最为有效的方法 尿激酶 蚓激 酶 蛇激酶等缺乏组织特异性 大剂量用药易引发出血 或溶栓后血管再闭塞 溶栓药多从动物体提取 周期长 成本高 价格昂贵 而且都有过敏反应或血管出血现象 而利用微生物技术生产溶栓酶具有周期短 产量高 生产 工艺简单 成本低等特点 已成为生物医药发展的一个重 要方向 豆豉纤溶酶具有许多生理活性功能 且源于我国传统 的药食同源食品 安全可靠 副作用小 已引起国内学者的 广泛关注 目前国外有关豆豉纤溶酶的报道较少 这就为 国内研究者充分利用本国资源开发功能性食品和天然抗 栓药物提供了优势 然而国内的研究主要集中在优良菌 种选育和传统工艺改造 豆豉纤溶酶的药理作用及机制 尚未被系统 全面地研究 对其功能成分的研究也鲜有报 Forum and Summary26 中国酿造 2010 年 第 9 期 总第 222 期 道 因此 科技工作者应借鉴日本对纳豆激酶的研究经验 深入研究我国豆豉 利用基因工程和蛋白质工程手段提高 豆豉纤溶酶的产量和酶的比活力 并且对豆豉特殊功能成 分进行分离提取 揭示药食兼用的豆豉生理活性物质 明 确其活性成分结构 作用机理及其加工稳定性等 从而使 具有中国特色的豆豉纤溶酶及豆豉保健食品走向世界 豆豉纤溶酶是豆豉中存在的最主要的活性成分 但 是由于生物活性酶在体内存在生物屏障 容易被消化道中 的水解酶降解 不利于口服吸收 王成涛等 28 通过构建豆 豉纤溶酶载酶纳米脂质系统 提高了豆豉纤溶酶在人工 肠液中的酶活保持率 陶琳等 29 研究了豆豉溶栓酶肠溶片 剂的制备及体外释放度 为研制新型口服溶栓药物 开发 预防血栓病的功能性食品提供了帮助 此外 豆豉营养丰 富 除富含豆豉纤溶酶外 还含有不饱和脂肪酸 多种维生 素 矿物质 蛋白质 大豆异黄酮 大豆低聚糖 大豆皂苷 大豆多肽 褐色色素 多聚谷氨酸和大量人体必需氨基酸 等生理活性成分 有望开发成新一代保健食品 30 31 参考文献 1 SUMI H HAMADA H TSUSHIMA H et al A novel fibrinolytic en zyme nattokinase in the vegetable cheese Natto a typical and popular soybean food in the Japanese diet J Cell Mol Life Sci 1987 43 10 1110 1111 2 KIM W CHOI K KIM Y et al Purification and characterization of a fib rinolytic enzyme produced fromBacillussp strain CK 11 4 screened fromChungkook Jang J Appl Environ Microb 1996 62 7 2482 2488 3 WANG S ZHANG C YANG Y et al Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme producedfromBacillus subtilisLD 8547 J WorldJMicrobioBiotechn 2008 24 4 475 482 4 向梅 吴思方 王伟平 等 豆豉纤溶酶产生菌的筛选及菌种鉴定 J 微生物学杂志 2005 25 1 21 24 5 彭勇 黄庆 张义正 枯草杆菌 DC 2 纳豆激酶基因的克隆及其融 合蛋白在 E coli 中的表达 J 中国生物化学与分子生物学报 2002 18 5 559 563 6 许金光 陈丽 产豆豉纤溶酶高产菌株的筛选及诱变育种 J 中国 酿造 2008 9 64 66 7 孙月娥 钱和 豆豉纤溶酶生产菌的诱变育种 J 河南工业大学学 报 自然科学版 2005 26 5 31 35 8 黎金兰 冯一森 曹峻松 等 两步固态发酵生产豆豉纤溶酶的研究 J 现代食品科技 2008 24 12 1304 1307 9 崔堂兵 韩双艳 舒薇 等 豆豉纤溶酶液体发酵生产条件的研究 J 郑州轻工业学院学报 自然科学版 2008 23 1 24 27 10 王成涛 籍保平 曹雁平 等 豆豉纤溶酶 Subtilisin FS33 的提取纯化 与鉴定 J 中国酿造 2009 2 29 33 11 齐海萍 钱和 王璋 等 淡豆豉纤溶酶的分离纯化 J 中国调味 品 2005 11 21 27 12 彭勇 张义正 解淀粉芽孢杆菌 DC 4 豆豉溶栓酶成熟肽编码序列 的克隆及表达 J 应用与环境生物学报 2002 8 3 285 289 13 WANG C JI B LI B et al Purification and characterization of a fibri nolytic enzyme ofBacillus subtilisDC33 isolated from Chinese tradi tional Douchi J J Ind Microbiol Biotechnol 2006 33 9 750 758 14 ZHANG R H XIAO L PENG Y et al Gene expression and characteris tics of a novel fibrinolytic enzyme subtilisinDFE inEscherichia coli J Lett Appl Microbiol 2005 41 2 190 195 15 LUO W H GUO Y HAN S Y High level expression of Douchi fibri nolytic enzyme DFE inBacillus subtilisWB800 J Chin J Appi En viron Biol 2007 13 4 565 569 16 吕美云 张新 陆云华 豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中 的表达 J 安徽农业科学 2008 36 6 2270 2271 17 崔堂兵 郭勇 罗文华 等 定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和 底物特异性的研究 J 自然科学进展 2008 18 7 826 832 18 张炳文 庞庆芳 孙超 对中国传统细菌型豆豉溶栓酶酶学性质的 研究 J 中国调味品 2008 12