高级生物化学实验报告-猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定

高级生物化学实验报告实验一 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老。抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、 pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000g。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氧化硝基四氮唑蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处应无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布活性大小）。二、实验试剂与器材【试剂】1、 SOD的提取ACD抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml；0.9%NaCl：称取NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中；丙酮95%乙醇氯仿2、 SOD活力测定50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液10mmol/L EDTA钠盐溶液3mmol/L 邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配置）3、 考马斯亮蓝G-250法测蛋白质考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白质25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。4、 SOD同工酶鉴定40%蔗糖（W/V）：称取蔗糖加重蒸水100ml；10%过硫酸铵（Ap）：称取过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中，用时现配；点击缓冲液：称取三是用现配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml。用时稀释10倍。30%的Acr-Bis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4保存；Tris-HCl，pH8.9缓冲溶液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，加1mol/LHCl48ml，TEMED 0.4ml，用浓盐酸调pH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml； Tris-HCl，pH6.7缓冲溶液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）6.0g，加1mol/LHCl48ml，TEMED 0.4ml，用浓盐酸调pH6.7后，再用蒸馏水定容至100ml；NBT溶液：核黄素（0.01%），氯化硝基四氮唑蓝（NBT）（25mol/L），磷酸缓冲液（0.05mol/L、pH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）2.8X10-3mol/L的EDTA-Na2（用pH7.8,3.6X10-3mol/L磷酸缓冲液配置）【器材】752分光光度计，分析天平，具塞试管，刻度吸管（1ml，5ml），离心机，烧杯（50ml），电泳装置一套，微量进样器，注射器。三、操作步骤1.SOD的提取1取新鲜猪血20ml（预先按0.15:1（V/V）的比例加入ACD抗凝剂）于50ml离心管，4000r/m，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min离心，去变性蛋白沉淀物（对有机溶剂敏感，沉淀下来），得上层液，记为V1，留样2ml。然后将清液在65-70恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/m，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，记为V2，留样2ml。3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，摇匀，冰箱静置1h，4000r/min，10min弃上清液，得沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，记为V3，V3=2ml，备用。2. SOD活力测定 1 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20分钟，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L HCl作空白，325nm波长下每隔30秒钟测光吸收值一次，整个操作在4分钟内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。2 酶活力测定操作与基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。 3 酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：其中，A0：为邻苯三酚自氧化率；Am：加酶后邻苯三酚自氧化率；总活性(U)单位活性酶原液总体积 4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）： 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂管号123456 蛋白质标准液(ml)00.20.40.60.81.0 蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20 考马斯亮蓝G-250(ml)555555盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10分钟，在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(ug)，计算其浓度。 结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。将测得的数据填入以下表格：提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性(U/ml)总活性(U)比活性U/mg. pr回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的四、结果与分析1 邻苯三酚自氧化速率的测定样品/时间(min)0.511.522.533.5450ul0.0110.021 0.031 0.041 0.053 0.066 0.078 0.090 40ul0.006 0.018 0.027 0.0440.0570.075 0.091 0.108 15ul（稀释2倍后）0.012 0.028 0.046 0.068 0.090 0.109 0.1310.159邻苯三酚自氧化率（A0）=0.072加酶样1后邻苯三酚自氧化率（A1）=0.020加酶样2后邻苯三酚自氧化率（A2）=0.025加酶样3后邻苯三酚自氧化率（A3）=0.0362酶活性单位的测定酶样1：单位活性=144.44酶样2：单位活性=130.56酶样3：单位活性=100.00X2=200.003总活性的测定酶样1：总活性（u）=1444.40酶样2：总活性（u）=1175.04酶样3：总活性（u）=400.004蛋白质含量标准曲线及蛋白质含量测定 根据以上公式计算得出： 蛋白质及浓度的测定样品A595蛋白质含量（ug）体积（ul）浓度(mg/ml)10.696167.884503.35720.32280.9072000.40530.478117.1861001.1725比活力的测定酶样1：比活力（u/ml）=43.03酶样2：比活力（u/ml）=321.58酶样3：比活力（u/ml）=170.656最终结果 最终实验结果提纯步骤酶液总体积ml蛋白质浓度酶单位活性酶总活性u比活性回收率%纯化倍数除血蛋白上清103.357144.441444.4043.03100.001.00热变性后上清90.405130.561175.04321.5881.357.47丙酮沉淀后的21.172200.00400.00170.6527.693.97从整个实验数据来看，丙酮沉淀后的酶液的回收率和纯化倍数比较高，相对来说，热变形后的酶液回收率和纯化倍数就要稍微低一点。从蛋白质标曲图的R2 =0.9096来看，实验结果不太准确，未达到0.999但可以作为本实验的参考，通过计算得到的蛋白质含量、酶活、比活力等数据可能不太准确，这可能与实验当时酶量称量不准确和操作过程有关。分离纯化要注意：防止酶变性失活，在实验的每一步都应该检测酶的活性，以确保酶的活性是否存在以及酶的纯化程度。此外本实验中猪血的新鲜程度、细胞裂解溶血程度等因素也会影响实验结果。实验二 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。二、 实验原理黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate +O2a Flavonol + succinate + CO2+ H2O。本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn 酶切位点，去掉终止密码并引入BamH 酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中应用广泛。三、 操作步骤3.1 样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。材料与试剂：重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50g/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS上样缓冲液。仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 L、200 L、1 mL）、微量加样器（10 L、200 L、1 mL）、离心管（1.5 mL、10 mL）。操作步骤：含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E. coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37培养16 h。挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 L）于37 过夜培养，即为种子液。按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 L），于37 培养OD600至0.5（约2.5 h）。加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 L），置于25连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液5 mL于10 mL离心管中，置于冰水混合物上备用。诱导完毕后，各样品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（5 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。各管分别加入400 L PBS重悬细胞，加入100 L 5 X SDS上样缓冲液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事项：重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。3.2 SDS-PAGESDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。材料与试剂： 分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。 30%丙烯酰胺/N, N-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。 10%过硫酸铵（W/V），需新鲜配制。 2 X 上样缓冲液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚蓝 0.5 mL，2-巯基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。 电极缓冲液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，调整pH后定容至1000 mL。 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。 脱色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。 封底胶：1g琼脂糖溶于100 mL电极缓冲液。 预染标准分子量蛋白质Marker。仪器与设备：垂直板电泳槽及其附件，电炉，电泳仪，微量加样器（10 L），Tip（10 L）。操作步骤： 电泳槽的安装：将成套的两块玻璃板正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝（注意分辨上下槽）。用1%的琼脂糖封底（封于下槽底部），待琼脂糖凝固后即可制胶。 制胶：选择合适的胶浓度，按下表配制分离胶，灌入两玻璃板之间，加至距短玻璃板顶端3 cm处，立即覆盖5 mm左右水层，静置等待聚合，当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明胶已聚合。小心倒掉分离胶上水层，配制浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙（该过程避免气泡的产生）。本实验选用12.5%的SDS-PAGE胶对重组FtFLS进行分离。试剂分离胶浓缩胶浓度7.5%10%12.5%15%30%4%分离胶缓冲液 mL4.04.04.04.04.0-浓缩胶缓冲液 mL-1.25Acr/Bis mL4.05.36.78.010.70.75H2O mL8.06.75.34.01.33.010% AP mL0.30.30.30.30.30.15TEMED mL0.0080.0080.0080.0080.0080.005 点样：分别在上下电泳槽中倒入电极缓冲液，上槽淹没短玻璃板，下槽淹没电极即可。此时，小心拔出梳子，用微量加样器调整点样孔之间的浓缩胶（此步骤应检查电泳槽是否漏液）。使用微量进样器分别在样品槽内分别加入预染的标准分子量蛋白质、诱导前0 h，诱导2 h、4 h、6 h和8 h后处理好的样品18 L（上样总体积一般不超过10 L，加样孔的最大限度可加15 L样品）。 电泳：接通电源，调节电压至90 V，恒压电泳；待指示剂进入分离胶后，调节电压至180 V恒压电泳。待指示剂在分离胶中迁移6 cm左右时，停止电泳。剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别），见图3和图4. 染色：凝胶经蒸馏水漂洗1次后加入染色液，电炉加热处理10-20 min染色。 脱色：使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。注意事项：上样总体积一般不超过15mL，胶孔的最大限度可加20mL样品。微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。电极缓冲液和AP应新鲜配制，上下槽缓冲液不可混用（电泳完毕分别收集）。3.3 转膜与杂交杂交膜的选择是决定Western blotting成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 m和0.2 m两种规格的NC膜。大于20 kDa的蛋白可用0.45 m 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 m的膜。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5 sec。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。材料与试剂：材料：PVDF膜，Whatman 滤纸，搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，试剂：转移缓冲液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS缓冲液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl调pH=7.6），脱脂奶粉、BSA或试剂盒自带的蛋白质干粉，洗涤缓冲液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封闭缓冲液（1TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脱脂奶粉或BSA），抗体稀释液1TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脱脂奶粉（单抗）。仪器与设备：转膜电泳仪及其附件，杂交仪，培养皿，凝胶成像系统。操作步骤：转膜 准备转移缓冲液，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将凝胶和PVDF膜和滤纸放入转移缓冲液中平衡5min。 装配转移三明治（海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵）：在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；将夹子打开使一面保持水平（规定为正极）。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。 将转移槽置于冰浴中，放入三明治，加转移缓冲液，插上电极，100V电泳1h（电流约为0.3 A）。 电泳结束，观察预染的蛋白质Marker是否转移到膜上。杂交 用25-50 mL洗涤缓冲液洗涤PVDF膜5 min, 1 次。 封闭PVDF膜：加封闭缓冲液25 mL，20-37封闭1-2 h。用量以浸没整张膜为准。 抗体的稀释（已稀释）：取10ul小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体加入10ml抗体稀释液，取20ul聚合过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG加入10ml抗体稀释液（一般特异性抗体浓度1 g/mL）。 PVDF膜孵育一抗：将稀释好的一抗全部加入培养皿中（已完全覆盖膜为准），20-37孵育2 h左右。 用25 mL洗涤缓冲液振荡洗涤PVDF膜3 次, 每次5 min。 PVDF膜孵育二抗：将25 mL二抗全部加入培养皿中（以完全覆盖膜为准），37 孵育1 h左右。 用洗涤缓冲液振荡洗涤PVDF膜4 次, 每次5 min。 DAB 显色：按每2 mL蒸馏水加显色剂A，B，C 各滴，混匀。混匀后加至膜上。室温显色。一般显色130 分钟。若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。注意事项： 操作中戴手套，不要用手触摸。如检测小于20 kDa的蛋白应用0.2m的膜，并可省略转移时的平衡步骤。某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.33% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。：电泳前应检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。四、实验结果4.1 考马斯亮蓝显色结果4.2 DAB显色结果五、讨论与分析1. 考马斯亮蓝显色结果由图可知，其变化趋势是目的条带颜色越来越深，条带宽度也逐渐变宽。说明随着培养时间推移，产生的目的蛋白越来越多，也就意味着转入的基因得到表达。而目的条带宽度在6h以后变化已经不明显，说明此时目的蛋白的表达已达到接近峰值。实验结果的背景色偏深，但还不影响结果的判定。2. DAB显色结果由于显色结果并不理想，不能清晰反映我们实验设计所需要的结果。上图显色结果为绘制的示意图。主要可能是因为一抗孵育时间较短导致，也可能是由于蛋白样品本身上样量不足或蛋白浓度较低，以及转膜转印效率不够高。另外，也可能由于以下这些方面没有严格做到影响了实验结果：A制作凝胶时，严格按照配方制作，倒胶时做到既快又稳，防止产生气泡。同时，制胶前应洗净玻板并使其完全干燥，否则会影响实验结果。B进入杂交阶段，重要的是控制温度和孵育时间，在孵育之前，封闭也是必不可少的步骤。显色效果与各个步骤都是密不可分的，但一抗、二抗品质与用量尤为重要。这一步必须尤为仔细。C 当进入转膜阶段时，注意转移三明治的顺序，海绵、滤纸、胶、膜，滤纸，海绵。还需要注意的是一定要驱赶完海绵里的气泡，不然会造成短路。D为提高实验准确度样品应按照以下标准：样品不能反复冻融，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。实验三 蛋白质分子量的测定凝胶层析法1、 原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不同。将凝胶颗粒在适宜溶剂中侵泡，是充分洗液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗头过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而是样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶是由胶体溶液凝胶而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙小，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是有Vo，Vi与Vg三部分组分，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用此式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒空隙间的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=（Ve-Vo)/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由gWR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际试验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。以上关系可用图1表示。图1 凝胶层析柱洗脱的三部分示意图 Vo表示外体积；Vi表示内体积；Ve、Ve分别代表组分和的洗脱体积。 Kd可以有以下几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于孔隙体积（图1组分）。 2、当Kd=1时，则Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为孔隙体积与内体积之和（图1组分）。 可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出得分子及Kd都等于0。虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它的一定使用范围。 3、当0Kd1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化（图1组分）。 4、有时Kd1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时VeVo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以gWR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出的Vi值得。另一个解决办法是不适用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：已知：Kd=（Ve-Vo)/Vi，Vt-Vo代替Vi则：Kav=（Ve-Vo)/（Vt-Vo）即：Va=Vo+Kav（Vt-Vo）在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一半层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型化合物，洗脱特性与组分分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logMK1与K2为常数，M为分子量，V额也可以用Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。曲线斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许工作范围内，曲线越陡，则分级越好，而工作范围越窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如蛋白类，左旋糖酐类等都有它自己的特殊选择曲线，可用以测定未知物分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在糖含量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法测分子量的结果，要和其它方法的测定相对照，由此才可作出可靠结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已经得到相应广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源动物以及测定高分子物质的分子量。下面实验是利用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质分子量。2、 试剂和器材【试剂】 1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD）,牛血清白蛋白（67KD）,胃蛋白酶（36KD），CytC（13.5KD）等，均为分析纯。 2、洗脱液：0.2mol/L Tris-HCl-KCl,pH7.5 取0.5M KCl 20ml， 0.2M Tris 25ml， 0.1M Hcl 40.3ml，再加H2O定容至100ml。 3、Sephadex G-75。【器材】 1、层析柱：柱管1.250。 2、核酸蛋白检测仪（或紫外分光光度计）。 3、部分收集器。 4、刻度试管。三、操作方法（一）凝胶柱的准备1、凝胶的选择和处理1凝胶的选择：G-75。当溶液通过G-75柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就能使蛋白质得到纯化。一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子量差别越大，分离效果越好。2凝胶的处理：葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用于作洗脱剂的相同液体中，充分溶胀，然后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积，计算所需凝胶干粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱夜中，一般多为水、盐溶液或缓冲液，放置在室温，使之充分吸水溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异。凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。2、凝胶柱的制备1柱的选择：层析柱是所有层析方法的主要组成部分。因此，对层析柱选择的合理与否，将直接影响分离效果。当用同样直径的层析柱分析两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高。一般理想的层析柱之直径和长度之比1:25100时。层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的结果容易重复。2装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径为1cm，如果样品量比较多，最好用直径为2-3cm。但若直径太小时会发生“管壁效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱过长，实验时间过长，而且样品稀释度大，易扩散，分离效果反而不好。先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降至柱高的1/41/3时，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液面缓慢下降至需要的高度。要注意颗粒间没有夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。3凝胶柱的鉴定：新装好的柱要检验其均一性。可用带色的高分子物质溶液过柱，观察色带是否均匀下降。如果凝胶是均匀的，没有“纹路”、裂缝或气泡，才可以使用，否则就必须重新装柱。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干，分离效果变坏，并有可能混入气泡，影响液体在柱内的流动。3、加样：加样量与测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。加样的方法与一般住层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开管夹，使样品溶液流入柱内。然后加入溶剂或盐溶液洗脱。4、洗脱：所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变形或失活为原则。洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝体积发生变化而影响分离效果。洗脱用的液体有水及电解质溶液。洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。流速亦受颗粒大小影响，颗粒大时流速较大，但流速大时洗脱峰形状较宽，颗粒小时流速较慢，分离情况较好。在操作时应根据实际需要，在不影响分离效果的情况下，尽可能使流速不致太慢，以免时间过长。5、 柱的重新填装：由于洗脱过程中，所有组分一般可全部自柱上洗下,所以装好一次柱管之后,可以反复使用，无须特殊的再生处理。但由于在使用过程中，颗粒可能逐渐沉积压紧，因此在使用一段时间后，流速可能逐渐减低，使一次分析时间拖得很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，则需将表面层除去。 由于由于葡聚糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它