21 生物化学实验--琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白.doc

琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白 【目的】 1. 掌握琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白的实验原理和操作方法。 2. 熟悉血清脂蛋白改变在临床上的重要意义。 【原理】 电泳是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其自身所带电荷相反的电极移动的现象。根据电泳支持物的不同，血清脂蛋白电泳可分为滤纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳四类。由于各种脂蛋白所含载脂蛋白和脂类的种类及数量不同，分子量大小相差较大，并且在一定 pH 值溶液中所带电荷量不同，电泳移动的速度必然有差别，因此，通过电泳可以将不同种类的血清脂蛋白彼此分离。 血清脂蛋白经苏丹黑 B 预染后，以琼脂糖为载体，在 pH 8.6 巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带（图 3-9 ）。正常人空腹状态下，血清脂蛋白电泳后可出现三条区带，从阳极到阴极依次为 - 脂蛋白带、前 - 脂蛋白带及 - 脂蛋白带。点样槽处不会出现乳糜微粒，有时前 - 脂蛋白也显示不出来。区带的宽窄及颜色的深浅粗略地反应了各种脂蛋白的量。 另外，可以将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。或者，将电泳后凝胶板上各区带切下，比色定量分析出各种脂蛋白的百分比含量。 图 3-9 预染血清脂蛋白电泳图谱 【器材】 1 电泳仪 2 恒温水浴箱 3 离心机 4 微量加样器 5 烫槽器 6 载玻片 7 扫描仪 8 分光光度计 9 小号试管 10 吸管 11 纱布 12 烘箱 【试剂】 1 电泳缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.075 的巴比妥缓冲液） 称取巴比妥钠 15.458g ，巴比妥 2.768g ，乙二胺四乙酸（ EDTA ） 0.29g ，加适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 2 凝胶缓冲液（ pH8.6 三羟甲基氨基甲烷缓冲液） 称取三羟甲基氨基甲烷 1.212g ， EDTA 0.29g ， NaCl 5.85g ，用适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 3 琼脂糖凝胶（ 1% ） 称取琼脂糖 1g ，溶于 50ml 凝胶缓冲液中，再加蒸馏水 50ml ，然后在水浴中加热至沸腾，待琼脂糖完全溶解后立即停止加热并分装于试管中，冰箱 4 保存，备用。 4 苏丹黑 B 染色液 将适量苏丹黑 B 加到无水乙醇中至饱和，震荡使之乙酰化，用前过滤。 5 固定液 取冰醋酸 5ml 加 75% 乙醇 95ml 。 6 预染血清 取空腹血清 0.18ml ，加苏丹黑 B 染色液 0.02ml ，混合后置于 37 水浴中染色 30min ， 2000r/min 离心约 5min 以除去悬浮于血清中的染料沉渣，取其上清液即为预染血清。 【操作】 1 制备琼脂糖凝胶板 将已配制好的 0.91% 琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在水平放置的载玻片上，每片约 3ml 。静置约 510min 即能凝固（天热时需延长时间，也可放入冰箱中数分钟加速凝固）。在即时凝固的凝胶板一端约 2cm 处用烫槽器加热后稍用力下压使之下陷接近玻片，切忌勿透，用滤纸片吸干槽中水分。 2 加样 用微量加样器取预染血清约 15l 注入凝胶板加样槽中。 3 电泳 将已加入预染血清的凝胶板水平移至电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用电泳槽缓冲液把四层纱布浸湿做成 “ 引桥 ” ，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约 1cm 左右， “ 引桥 ” 的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，使血清样品扩散进入凝胶， 5min 后接通电源，电压 120130V ，电流约为 34mA/ 凝胶板，电泳 4050min ，待最前端区带电泳至玻片 2 3 处时即可终止电泳。 4 固定 将电泳后的凝胶板浸入固定液中固定约 20min ，以增强区带的不溶性和加强与染料的结合力。 5 漂洗与烘干 将固定后的凝胶板用自来水漂洗数次，然后置于 80 烘箱中烘干成薄片状保存或进行扫描定量。 6 定量测定 （ 1 ）扫描定量：将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。 （ 2 ）比色定量：将电泳后凝胶板上各区带切下，另外取相当于区带宽窄的无色凝胶作为空白对照，分别移入盛有 3ml 蒸馏水的试管内，将各管同时置于沸水浴中 5min 溶解为透明澄清的溶液，稍冷却，用分光光度计，选波长 600nm ，分别记录各管吸光度值。 【计算】 血清某种脂蛋白占血清总脂蛋白的百分比，按以下公式计算： 【注意事项】 1 电泳样品应为新鲜的空腹血清。 2 加热溶化琼脂糖时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。 3 点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。 4 琼脂糖凝胶的浓度如果大于 1% ， - 脂蛋白和前 - 脂蛋白不易分开；浓度过低，则凝胶的机械强度太低，不易操作。 5 浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。 6 将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置阴极、引桥纱布不能搭在样品上。 7 如果用一形状大小和小槽一样的有机玻璃片，在琼脂糖凝胶凝固前固定于适当位置上，当凝固后取出有机玻璃片，凝胶板上即留下小槽可直接加样。 8 正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量参考值见表 3-11 。 表 3-11 正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量 种类 含量 - 脂蛋白 53.1 5.1 前 - 脂蛋白 15.1 4.