标书姜黄素结肠靶向微球的研究.doc

题目：姜黄素结肠靶向微球的研究一、研究意义：姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科姜黄属curcuma longa L.植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取出的一种天然酚类色素。它具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用。其中，姜黄素对肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌等癌症细胞的产生、增值、转移均有抑制作用。研究表明，姜黄素可以通过影响信号转导途径中的多个靶因子产生抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。美国国立肿瘤所已将其列为第3代抗癌预防药，已经成为肿瘤预防和治疗的热点药物。在国外，姜黄素在炎症和癌症治疗方面研究的II期和III期临床试验正在开展，但是，姜黄素在体内能够快速代谢，其生物利用度比较低1，因此，为了达到靶部位的治疗浓度需要增大给药剂量。然而，给药剂量的增加势必会带来较大的副作用。本课题把姜黄素做成结肠靶向的微球制剂，使其在胃和小肠的环境中不释放药物，而在结肠的生理条件下特异性释放姜黄素，将药物浓集于靶区，不仅能够提高局部药物浓度，而且能够减少给药剂量从而降低药物的毒副作用，从而达到有效治疗结肠癌的作用。参考文献：1 Juenka,Julie S. Anti-inflammatory properties of curcumin, a major constituent of curcuma longa :a review of preclinical and clinical researchJ.Altern Med Rev,2009,14(2):141-153.二、国内外研究概况：结肠癌是结肠部位常见的消化道恶性肿瘤，它与肺癌、前列腺癌、乳腺癌等癌症已经成为人类的健康杀手。一般治疗结肠癌的药物由于在经过上消化道时有药量损失，因此要想在靶部位达到治疗浓度，需提高用药剂量，这样治疗药物为病人带来的副作用会比较大。因此，具有结肠靶向的治疗结肠癌的药物制剂亟待开发。口服结肠靶向给药系统（OCDDS）是上世纪90年代后期发展起来的新型给药方式。由于它能够提高药物疗效，降低药物引起的全身不良反应，因此在结肠癌的治疗中有着重要意义。结肠是难溶性药物吸收的高度响应位置1，因此，我们可以将某些难溶性药物制成结肠靶向给药制剂，来提高其生物利用度。姜黄素的药理作用广泛，特别是在结肠癌的治疗中有着重要作用。但是它在水中的溶解度小，在中性、碱性条件下易于降解。因而其口服给药制剂在消化道的碱性条件下容易被破坏，使其到达结肠的浓度降低，并且由于溶解度低会给它的吸收带来困难。因此，我们将把姜黄素制成HP-CD的包合物、或者把F127、F68与姜黄素做成固体分散体以解决它的溶解度低的问题。微球是近年来发展起来的新剂型，可以提高药物的稳定性，对药物具有缓释及靶向作用。于是，把姜黄素做成微球而形成结肠靶向制剂用以治疗结肠癌的思路便产生了。接下来，便要解决姜黄素微球载体材料问题。果胶（pectin）是一组半乳糖醛酸2，常由苹果、柑橘、柚子等水果中提取出来。果胶根据甲基化程度分为高酯果胶和低酯果胶，后者又包括酰胺化果胶。它能被结肠中的多糖酶特异性降解，但是天然果胶在水、酸和碱中有一定的溶解度，使其在结肠靶向载体的应用中受到了限制。但是如果将低酯果胶（LM50%)进行钙化,形成“蛋-盒”式3不溶于水的果胶钙，便可以作为水溶性药物、水不溶性药物、蛋白质药物结肠给药的载体。Surajit Das等4制备了白藜芦醇果胶钙毫米级球体，作为结肠靶向给药制剂。姜黄素与白藜芦醇的性质相近，均不溶于水。因此，我们所研究的姜黄素果胶钙微球在上消化道不被破坏，到达结肠后，被结肠内的细菌产生的果胶水解酶降解，释放姜黄素。此载体材料的另外一个优点是：材料在体内降解产物为单糖，对机体无毒副作用。为了保证姜黄素能够顺利到达结肠部位，发挥药效，我们将合成的姜黄素果胶微球进行包衣。选用的包衣材料为Eudragit S1005,这类丙烯酸共聚物属于pH敏感性材料，在pH高于7.0的环境中降解，从而达到结肠靶向的作用。Jain6等制备了氟尿嘧啶的果胶钙毫米级球体，后用Eudragit S100包衣，体外实验证明给此制剂具有良好的结肠靶向作用。 我们制备的Eudragit S100包衣的姜黄素果胶微球，具备pH敏感性和菌群触发式两者的优点，能够保证药物在结肠释放药物。参考文献：1 Minko T. Drug targeting to the colon with lectins and neoglycoconjugatesJ.Adv Drug Delivery Rev,2004,56:491-509.2 Marshall L,Fishman,Hoa K.Chau,et al.Solvent effects on the molecular properties of pectinsJ.Agric Food Chem,2001,49:4494-4501.3 Liu,LinShu,Marshall L.,Fishman,et al. Pectin-based systems for colon-specific drug delivery via oral routeJ.Biomaterials,2003,24:3333-3343.4 S.Das,K.-Y.Ng. Colon-specific delivery of resveratrol: Optimization of multi-particulate calcium-pectinate carrier J. Int J Pharm,2010,385:20-28.5 Obaidat WM,Obaidat IM. Effect of the dispersion of Eudragit S100 powder on the properties of cellulose acetate butyrate microspheres containing theophylline made by the emulsionsolventevaporation methodJ. Journal of Microencapsulation,2007,24(3):263-273. Academic Journal Academic Journal6 Jain A, Gupta Y, Jain SK.Potential of calcium pectinate beads for target specific drug release to colon J. J Drug Target, 2007,15(4):285-294.三、特色创新之处：本课题的特色是：将姜黄素制成Eudragit S100包衣的果胶微球，使其在结肠的生理环境下释放药物，达到有效治疗结肠癌的作用，该研究思路未见国内外文献报道。本课题的创新之处为：1.由于姜黄素难溶于水，我们将比较姜黄素果胶微球和用HP-CD，F127或者F68对姜黄素增溶后制备的果胶微球体外释放的区别。2.对比包衣前和包衣后微球的体外释药行为，并且研究包衣后的微球在大鼠盲肠内容物存在条件下制剂的释药行为与前者有何区别。3.研究姜黄素微球在大鼠胃，小肠，盲肠，结肠四个部位的分布情况。4.建立大鼠结肠癌病理模型，比较姜黄素和姜黄素微球对结肠癌的治疗作用。四、研究内容：1.姜黄素微球的处方筛选、采用均匀设计优化制备工艺：以粒径，包封率，载药量为指标进行处方优化。2.将制备好的姜黄素果胶微球进行包衣。3.用粉末衍射和DSC验证微球是否形成，用扫描电镜观察微球的表观形态。4.考察微球粒径及粒径分布。5.考察微球的稳定性。6.体外释药行为研究：研究姜黄素果胶微球在包衣前后释药行为，并且研究在大鼠盲肠内容物存在下包衣后微球的释药行为。7.考察姜黄素微球在大鼠胃，小肠，盲肠，结肠四个部位的分布情况。8.对比姜黄素和姜黄素微球对患有结肠癌大鼠的治疗作用。五、研究目标：1.姜黄素果胶微球的粒径应在2050m1-2；2.制剂应该具备良好的稳定性。3.该制剂应该具备良好的结肠靶向作用。4.该制剂能有效的治疗结肠癌。参考文献1 Wong T. W. ,Lee H. Y. ,Chan L. W. ,et al.Drug release properties of microsphere prepared by emulsification methodJ. Int J Pharm,2002,242:233-237.2 Chaurasia M,Chourasia M.K. ,Jain,et al.Methotrexate bearing calcium pectinate mirospheres: a platform to achieve colon-specific drug releaseJ.Current Drug Delivery,2008,5:215-219.六、拟解决的关键问题：1.姜黄素微球的处方筛选与工艺优化。2.姜黄素微球的包衣。3.姜黄素微球的体外释放考察（包衣前后、包衣后微球在大鼠盲肠内容物存在和不存在三种条件下）。4.姜黄素微球在大鼠胃，小肠，盲肠，结肠四个部位的分布状况。5.对比姜黄素和姜黄素微球对患有结肠癌大鼠的治疗作用。七、研究方法与实验方案：1、姜黄素果胶钙微球的制备：以二价阳离子钙作为交联剂，在电磁搅拌的条件下采用乳化交联的方法制备果胶钙微球。先进行单因素考察，找出影响微球形成以及粒径、包封率、载药量的关键因素，然后进行均匀设计，找出最优处方。2、微球的包衣：采用最优处方制备姜黄素果胶微球，以Eudragit S100为包衣材料，采用O/O溶剂挥发法对姜黄素微球包衣。3.姜黄素果胶微球的理化性质考察：3.1 考察姜黄素果胶微球的外观形态，微球表面形态及圆整度（扫描电镜），微球的粒径及粒度分布。3.2 姜黄素果胶微球的溶胀性考察。3.3 姜黄素果胶微球形成的验证：用DSC和粉末衍射的方法验证微球是否形成。4.初步稳定性试验：将包衣以后的姜黄素果胶微球干燥粉末密封于棕色西林瓶中，分别于冰箱内（35）、室温（1525）与37条件下3个月，对其外观，形态含量进行考察。5.体外释放试验5.1 释放介质的选择及各个时间段选择：由于姜黄素在水中的溶解度极小，并且在中性及碱性介质中不稳定，易于降解。因此，在模拟胃肠液条件下考察溶出度时，我们搜集各个时间段的微球测定剩余药量1，以估计各个阶段释放的药物量。下面为各个时间段的选择：0-2h，以pH=1.2的盐酸溶液作为溶出介质（胃蛋白酶存在与不存在两种情况）；3-5h，以pH=6.8的PBS缓冲液为溶出介质（胰蛋白酶存在与不存在两种情况）；6-24h，以pH=7.0的PBS缓冲液为溶出介质（果胶酶存在与不存在两种情况）。5.2 按照上述方法对包衣前后的果胶微球进行体外释放行为的考察5.3 在大鼠盲肠内容物存在条件下研究包衣后微球的释药行为2:正常饲养体重150200 g的大鼠，每天灌胃给予2%果胶/ES100的水溶液，持续7天。在试验前30分钟，处死大鼠，结扎盲肠，取其内容物作为模拟结肠环境。6.姜黄素微球在大鼠消化道内的分布情况：以雄性大白鼠为实验动物，设置空白对照组，口服姜黄素组，口服姜黄素微球制剂组三个组，于2、4、6、8h四个时间段处死大鼠，分别取胃，小肠，盲肠，结肠四个部位进行处理，考察姜黄素及其制剂在大鼠体内的分布情况。27.大鼠结肠癌模型的建立：试验动物为体重130-150g的wistar大鼠，雌雄各半。每周一次连续18周给大鼠腹股沟皮下注射二甲肼（20mg/kg）建立大鼠结肠癌模型3。将试验动物随机分为四组：第一组为阴性对照组，给予与二甲肼相同体积的生理盐水；第二组为阳性对照组，给予二甲肼溶液，建立结肠癌模型；第三组为姜黄素组，连续32周按体重给予大鼠灌胃姜黄素溶液同时给以二甲肼皮下注射；第四组为姜黄素微球组，连续32周按体重给予大鼠灌胃姜黄素微球溶液同时给以二甲肼皮下注射。7.1 第12周时每组取10只大鼠，观察其ACF（异常隐窝灶）形成情况。4取下整段结肠，纵向剖开，用生理盐水冲洗，然后固定甲醛溶液中24h。用亚甲蓝染色后在光学显微镜下计数ACF个数。7.2 实验第32 周，剩余所有大鼠3戊巴比妥钠腹腔麻醉，取结肠组织观察各组肿瘤形成情况。3戊巴比妥钠腹腔麻醉，沿前正中线剪开胸腹膜，分离大鼠结肠并切下。检查肝、脾、胰核肠系膜淋巴结等组织。切下的结肠去脂肪组织，沿肠系膜附着物纵向剖开整个肠道，生理盐水冲洗干净。肠组织平铺于塑料板上，粘膜面向上，记录肿瘤的部位、形态和大小。标本用甲醛固定,切取理想组织，石蜡包埋，常规切片和HE染色5。参考文献： 1 S.Das,K.-Y.Ng. Resveratrol-loaded calcium-pectinate beads: effect of formulation parameters on drug release and bead characteristicsJ. J Pharm.Sci,2010,99(2):840-860.2 Paharia A,Yadav A K,Rai G,et al.Eudragit-coated pectin microspheres of 5-Fluorouracil for colon targetingJ.Pham Sci Tech,2007,8(1).3 Xu Gang,Ren Guijie,Xu Xia,et al.Combination of curcumin and green tea catechins prevents dimethylhydrazine induced colon carcinogenesisJ. Food Chem Toxicol,2010,48:390-395.4 Dias MC,Spinardi-Barbisan AL,Rodrigues MA,et al.Lack of chemopreventive effects ginger on colon carcinogenesis induced by1,2- dimethylhydrazine in ratsJ. Food Chem Toxicol,2006,44(6):877-884.5 Onose J, Imai T,