载脂蛋白D的结构、功能及临床应用.pdf

细胞生物学杂志 C h i n e s e J o u r n a l o f C e l l B i o l o g y 2 0 0 8 3 0 5 0 5 4 h t t p ww w c j c b o r g 载脂蛋 白 D 的结构 功能及临床应用 王 磊 宿红艳 明永飞 赵志文 鲁东大学生命科学学院 烟台 2 6 4 0 2 5 山东警察学院刑事科学技术系 济南 2 5 0 1 0 0 摘要 载脂蛋白D a p o l i p o p r o t e i n D a p o D 是一个2 9 k D a 的糖蛋白 它最初是在人血浆的 高密度脂蛋白中被分离出来的 a p o D在结构上与其他类型的载脂蛋白存在很大的差异 被归入脂 肪促成素家族 a p o D可以与胆固醇 黄体酮 胆红素等多种疏水I陛小分子结合 另外 a p o D在多 种脊索动物的各类组织中广泛表达 揭示了a p o D在脊椎动物中重要的生理功能 最近的研究表明 a p o D可以作为多种癌症及神经系统疾病的早期诊断标记 因而备受关注 所有这些显示 a p o D是 一 个多配体 多功能的蛋 白质 关键词 载脂蛋 白D 结构 功能 临床应用 众所周知 脂类 向身体各部位的运输是靠脂蛋白 1 i p o p r o t e i n s 来完成的 血浆 中的各类脂蛋 白都 由 蛋 白质和脂类两部分组成 其蛋白质部分主要为载脂 蛋 a p o l i p o p r o t e i n a p o 现 已发现 的载脂蛋 白有 2 O种之多 主要有 a p o A a p o B a p o C a p o D a p o E a p o J 等类型 其中载脂蛋白D a p o l i p o p r o t e i n D a p o D 是分子量为 2 9 k Da的糖蛋 白 主要存在于 人类和其他生物血浆中 并与高密度脂蛋白 h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n H DL 结合 由于 a p o D的结构及合 成部位与其他载脂蛋 白的差别很大 故 a p o D是一类 非典型 的载脂蛋白 被归入脂肪促成素基 因超家族 1 i p o c a l i n s u p e r f a mi l y 中 该家族的成员都有相似 的结构并可作为疏水的小分子物质的载体 a p o D也 发现具有脂肪促成素基因超家族的结构特征 并能结 合胆 固醇 黄体酮 孕烯醇酮 亚铁血红 素相关 化合物及花 生四烯酸等疏水小分子 z Ap o D于 1 9 6 3 年首次在人类 的血浆中被发现 3 Mc C o n a t h y等 4 将人的 a p o D从血浆高密度脂蛋 白中 分离出来 后来免疫双扩散实验证实a p o D同样也 存在于极高密度脂蛋 白中 此外 在极低密度脂蛋 白中也有少量 a p o D的存在 目前人们已经在 a p o D 的结 构 表达与调控 以及 功能等方面展开研 究 1 A p o D的结构 对 a p o D分子水平 的研究所涉及 的物种 比较少 目前 a p o D只在5 种脊椎动物中被克隆和测序 包括 人 猴 子 猪 兔 子 老 鼠和鸡 s 们 最近 我 们在头索动物文昌鱼中也克隆到了a p o D c DN A t D r a y n a 等 首次克隆到了人a p o D c DN A 该基因 c DNA全长 8 8 5 b p 基因组 DNA长 2 O k b 由 5个外 显子和 4个内含子组成 内含子和外显子的这种排列 方式与其他载脂蛋白不 同 是脂肪促成素家族 的特 征 在启动子区域有很多调控元件 有雌激素反应 元件 黄体酮反应元件 肾上腺皮质激素反应元 件 脂肪反应元件和 甲状腺激素反应元件 以及血 清反应元件 急相期反应元件 金属反应元件 胁 迫反应元件和 固醇依赖型阻遏子等 n 这些不 同调 控元件的存在反映出人 a p o D表达调控 的复杂性 2 Ap o D的结构 2 1 Ap o D的一级结构 Mc C o n a t h y 等 4 分离人的a p o D时就已确定 a p o D 是一种糖蛋 白 由一条单一的肽链组成 糖基化部分 占蛋白质总量的 1 8 而其他载脂蛋白中碳水化合物 的含量仅 1 0 由c DNA推断出的蛋 白质一级结构 中含 1 8 9个氨基酸 其中包含 由2 O个疏水氨基酸组 成的信号肽 经加工后可成为 N端是谷氨酸的 1 6 9个 氨基酸残基组成的成熟蛋 白质 该氨基酸序列与其 他 的载脂 蛋 白没有相 似性 但与视黄 醇结 合蛋 白 r e t i n o l b i n d i n g p r o t e i n R B P 有 2 5 的一致性 与昆 虫的胆汁三烯结合蛋 b i l i n g b i n d i n g p r o t e i n BB P 有 3 0 4 0 的一致性 以上的这两种蛋白质都属于 脂肪促成素家族 当时称为 一 微球 蛋 白家族 除 收稿 日期 2 0 0 7 0 9 1 1 接受 日期 2 0 0 7 1 1 1 5 国家 自然科学基金 No 3 0 7 4 0 0 1 7 鲁东大学校科研基金 No 2 0 0 6 3 3 0 1 资助项 目 通讯作者 T e l 0 5 3 5 6 6 9 5 9 6 1 E ma i l s u h o n g y a n 6 6 1 2 6 c o m 与世界接轨 用宝尔超纯水系统T e l 0 2 1 3 1 2 6 3 2 6 8 WW W b a o l o r C O 1 维普资讯 磊等 载脂 蛋白D的结构 助能及临床应用 RBP B B P和apoD之外 D乳球蛋 白 D 1act oglobulin 昆虫 花青苷 insectiCYanil l 和气味物 质结合 蛋 白 odorant b i ndingpr otein 都属 f此家族 脂肪促成素 家族成员均具有的两个特征序列是 A sn h yd aci dic hyd X basi c h yd X G l y X T rp aro X hyd hyd h yd hyd和aro X hyd hyd X T hr A sp T yr A sp X aro hyd hyd h yd 其 中的 aci dic指的是酸性氨基酸 basic 指的足碱性氨基酸 hyb指的是疏水性氨基酸 ar o指 芳香族氨基酸 X则代表任意 的氨基酸残基 apoD 除了含有上述脂肪促成素家族的特征基序外 它们N 末端还含有 一 个由20个疏水氨基酸组成的信号肷 2个天 冬酰氮糖基化位点和5个保守的半胱氨酸 图 1 人apoD的结构与功能关 系研究表 明 C ys 与 CvsI l 以及Cys 4 1 与Cys m 之 间可 以形成链 内二硫键 Cvs s则可以同其他生物大分子形成链问二硫键 这 对维持apoD的空间结构和生理作用极为重要 1 Western杂交结 果显示 apoD在HD L和极高密度脂 蛋 N veryhi ghdensi t yl i poprot ein V HDL 中的杂交条 4 4 7 带 分别为29k Da和38k D a 氨基酸顺序分析证实 29 kDa处的带是处于还原状态 的apoD 而38k D a处 的带是apoD和apoA I通过二硫键结合成的异二聚 体 apoD以二硫键与apoA I结合是血浆中 apoD存 在的主要 形式 apoD通过与apoA I形成聚合物向任 外围与H D L结合 在低密度脂 蛋 白 10w den sity l i poprot ein L D L II极低密度脂蛋 白 verylowdensity li poprot ein V LDL 中也发现apoD和apoB 一 100形成的 异 聚体 2 2A poD 的二级和三级结构 载脂蛋白家族其他成员如apoA apoE等的二 级结构以仪螺旋为土 而apoD的结构经预测主要 由 6片层结构组成 0 螺旋 则少于5 引此 apoD的结 构与其他载脂 蛋 白明显不 研究表 明apoD具有 脂肪促成素家族成 员的结构特征 人apoD的晶体结 构与昆虫的B BP的结构非常接近 并f 1半胱氨酸和 二 硫键的位置也是保守的m 1 从蛋 白质数据库 protein databank P DB 中我们检索到了人apoD P D B检索 47 囫 4 7157 human m acaque pig r ab bif rat mO u S C chicken human m acaque pig r ab bit rat m O US C chicken human m acaque pig r ab b it rat m oUsc chicken 图1 A poD 家族成员 比序分析 阴影表示 相 同的氨基酸序列 一 示序列比较时产生的序列间的空隙 N端的信 号肽用方框包围 保守的半胱氨酸残基用星 号标识 两 个天 冬酰 氨糖基化位 点用 井 号标识 孝 两个脂 肪促生成素家族的特征序列用 下划线表 示 a 适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统 使实验数据更逼真 Tel 021 31263268 WWW baolor tom 维普资讯 5 2 综述 图 2 Ap o D的三维 结构 图 柱 状物 代表 a螺 旋 带 状物 代表 B片 层 号 2 HZ R 的晶体结构 图 2 可 以看出载脂蛋白 D是 由8 个反向平行的B片层围绕形成了B 桶状的超二级 结构组成的 顶端开口底部闭合 并且在 C末端连有 一 个 仅螺旋结构 这反映 了a p o D作为疏水小分子 载体的特性 a p o D的 B 桶状结构主要是由疏水侧链 构成 成为一个结合配体的空腔 可以结合黄体酮等 疏水配体并把它们运输到各组织 中 同时 a p o D的 疏水性表面可 以使其与 HDL或脂膜结合 发挥生理 作 用 3 A p o D在生物体内的表达分布 No r t h e r n杂交和原位杂交结果表 明 a p o D不 同 于其他类型的载脂蛋 白主要局 限于肝脏或肠道中表 达 其表达的组织器官更为广泛 自上世纪 9 0年代 开始 人们 陆续 研 究 了人 猴 子 老 鼠 兔 子 猪等哺乳动物中的 a p o D的组织表达情况 发现 a p o D 在大脑 小脑和脊髓等 中枢神经 系统中高度表达 在肾脏 脾脏等内脏器官 以及卵巢 睾丸等生殖器 官中也有不 同程度的表达 而在肝脏和肠道中的表达 水平较低 l 6 t 6 9 Vi e r i a 等 l 7 在鸡快速生长的卵母细 胞的卵黄中检测到 a p o D 这是首次在非哺乳动物 中 发现 a p o D的存在 并由此推测在 卵生生物 中a p o D可 能在胚胎发生过程中起着运输血浆 中的脂类到卵母 细胞 的特殊作用 Ga n f o r n i n a等 t o 克隆到 了鸡的 a p o D 并比较 了鸡和鼠 a p o D的表达模式 胚胎原位 杂交和 R T P C R表 明鸡的 a p o D在胚形成晚期的神经 细胞和神经胶质细胞中开始表达 而与 鼠a p o D所不 同的是其在神经嵴衍生的头部间叶细胞和血管周围 细胞中不表达 鸡 中a p o D 的发现将该基因的起源 追溯到了 2 5亿年前 即羊膜动物 开始分化 的时期 同时 根据哺乳动物和鸟类 a p o D在神经外胚层衍生 的中枢神经系统 中的表达模式 Ga n f o mi n a 等推测在 哺乳动物和爬行动物的共同原始祖先中 a p o D也是在 神经系统 中特异表达 的 a po D 在生物体 的多种组 织 中以不同水平表达表 明a p o D在生物体内发挥重要 的作用 同时也表明 a p o D可能有多种组织特异 的配 体 并在不同组织 中有着不 同的生理功能 从头索动物文 昌鱼 的肠 c DN A文库中也分离到 了a p o D 并利用 No rt h e r n杂交和原位杂交对文昌鱼 a p o D的时空表达模式进行 了深入的探讨 结果发现 其表达模式明显不同于其他 已知物种中的情况 在文 昌鱼 中a p o D主要在后肠和脊索中表达 而在神经系 统 中不表达 表现 出很多原始 的特征 这为揭示 a p o D在发育中的作用 以及脊椎动物的进化历程提供 参 考 4 A p o D表达 的调控 大量的研究表明 a p o D 的表达受很多因素的调 控 人们首先发现类 固醇类激素对 a p o D表达的影 响 在 AR 一 7 5 1乳腺表皮癌细胞和 L N Ca P前列腺癌 细胞中 雌激素雌二醇抑制 a p o D的表达 而雄性激 素二氢睾丸酮以及的塞米松则能增强 a p o D的表达 l 8 在体外培养的细胞中a p o D的表达量还与细胞的增殖 呈负相关 细胞生长抑制及衰老可 以增加 a p o D 的表 达 1 9 1 另外 白介素 一 1 仅 视黄酸 羟基胆固醇等 因素也都可 以增加 a p o D 的表达 2 0 分析人 a p o D 的上游启动子部分表明该区域存 在着一系列的转录调控和反应元件 其中就包括雌激 素 孕激素 糖皮质激素等类固醇类激素的调控元 件 以及与细胞生长抑制有关的血清反应元件 这也 从一个方面解释 了上述a p o D mR NA的表达受激素和 细胞生长抑制调控的现象 将 a p o D 的启动子同荧 光素酶的报告基 因相连接研究 a p o D在 鼠纤维原细胞 中的表达情况 缺失突变实验表 明一 1 7 4至 一 4部分是 启动 a p o D表达的关键部分 而 一 5 5 8至 一 1 7 9区间则 与细胞生长抑制导致的 a p o D表达量升高有关 5 A p o D的生理功能和临床研究进展 5 1 生理功能 由于a p o D在各种组织中广泛表达 并且a p o D作 为脂肪促成素家族成员可以与胆固醇 黄体酮 孕 烯醇酮 胆红素 花生四烯酸等配体结合 人们推 测a p o D在不同组织或器官中可能通过与不同的配体 结合发挥不 同的生理作用 此外 a p o D众 多的调 与世界接轨 用宝尔超纯水系统T e l 0 2 1 3 1 2 6 3 2 6 8 WWW b a o l o r c o rn 维普资讯 王磊等 载脂蛋白D的结构 功能及临床应用 5 3 控 结合元 件和复杂的表达调控 也反映 出 a p o D作 为一种多配体 多功能蛋 白的可 能性 2 1 1 作为人体血浆H DL和V HD L中的一种载脂蛋白 a p o D有结合和转运脂质的功能 人血浆 中 a p o D与 a p o A I 和卵磷脂 胆固醇酰基转移酶 1 e c i t h i n c h o l e s t e r o l a c y l t r a n s f e r a s e L C AT 形成一个复合体 它们之 间可以协同作用 a p o A I 调节 L C A T活力 L C AT催 化胆固醇转变为胆固醇酯 最后由 a p o D将胆 固醇酯 转运到 L D L和 V L DL中 由于此复合体承担胆固醇 酯 的合成和转运 维持体 内平衡 故被称为 胆 固 醇酯转运复合体 同时 a p o D还能稳定 L CAT活 力 是 L CAT的潜在激动剂 因此 a p o D在调节胆 固醇的代谢 中起重要作用 Ap o D存在于正常人的中枢和外周神经系统中 不论血浆中的 a p o D还是脑本身合成的 a p o D均能结 合血浆 细胞间隙和脑脊液 中的胆固醇及其衍生物 便于胆固醇等疏水物质 自由通过血脑屏障 对脑的脂 质 转运 和维持脂质代谢平衡起重要作用 研究表明 泪腺也能合成 a p o D a p o D与泪液 中 其它脂质相互作用 可起清洁作用 保护角膜免受亲 脂分子的损害 2 2 1 此外 a p o D还是抗氧化防御系统 的一部分 保护细胞和组织免受氧化损害 1 5 1 5 2 临床研究进展 随着对 a p o D生物医学研究的深入 人们逐渐开 始对其较为关注 这主要是源于 a p o D的表达与许多 临床 病理症状的关联性 首先在脂类代谢与动脉粥样硬化的研究领域 研 究表 明血浆中a p o D的水平与HD L中的胆固醇之间存 在着相关性 并参与了胆固醇或其他类固醇的酯化过 程 并且发现 了a p o D在动脉粥样硬化斑块处聚集的 现象 2 3 1 在肿瘤患者中人们发现 了a p o D高表达的情况 在女性乳腺囊性疾病和乳腺肿瘤患者中 囊肿综合征 流出蛋 白G C D F P 一 2 4 又称为黄体酮结合蛋 白 的浓度 显著升高 GC DF P 一 2 4约 占囊液中全部蛋 白质总量的 5 0 后来人们研究发现 a p o D即是该蛋白质 研究 者又陆续在前列腺癌 乳腺癌 子宫内膜癌 卵巢 上 皮癌 肝癌等病例 中发现 了 a p o D 的高表达情 况 引 更为重要的是人们注意 lJ a p o D在正常的中枢神 经系统中由星形角质细胞分泌并高度表达 2 9 这与花 生四烯酸的转运 代谢和信号转导存在这一定的联 系 而在病理条件 下此表达 水平还会进一 步升 高 大量报道表 明在多种神经系统功能失调疾病患者 的 脑脊液和血浆中 a p o D 的含量明显增高 这些疾病包 括 脑损伤 阿尔茨海默病 Ne i ma n P i c k病 帕 金 森 病 中风 脑膜 炎 痴 呆 和 精 神 分裂 症 等 2 9 3 2 1 因此 人们认为可将 a p o D作为一个敏感的分 子病理生理标记 根据 a p o D的免疫反应来进行心血 管疾病 癌 症和神经 系统疾病等 的早期预测 和诊 断 除此之外 这些研 究可望为相关疾病发病机制 的探讨及其防治寻求新的措施 开拓新的前景 人 们也 由此联想到利用 a p o D作为靶位来治疗心血管疾 病 癌症和神经 系统疾病的可 能性 但是人们至今 尚不能确定是由于 a p o D的高表达导致 了疾病的发生 还是由于机体的防御反应使病患部位 a p o D的浓度升 高 Wa l k e r 等 3 3 曾在果蝇中利用过量表达的方法研 究了 a p o D的同系物 h o mo l o g Gl i a l L a z a r i l l o GL a z 发现G L a z 的过量表达能导致果蝇的抗逆能力的增加 并延长其寿命 推测人类 的a p o D或许可以作为治疗 对象在抵消某些神经系统疾病 中发挥保护作用 人 们还对脂蛋 白代谢紊乱与载脂蛋 白分子缺 陷的相关 性进行调查 人们发现 a p o D呈现多态性 a p o D结构 基因或其调控区序列的突变与高脂血症或早发动脉 粥样 硬化存在一定 的关联 6 展望 对于 a p o D的研究 已经取得了一定的进展 大量 研究表明a p o D可能是一个多配体 多功能的蛋 白质 a p o D在多种脊索动物 中的表达情况反映了 a p o D在 脊椎动物进化 中的起着重要的作用 对 a p o D在不同 生物表达 图式 的比较将 有助于推 断生物 的进 化过 程 此外 大量关于 a p o D在相 关疾病 中的表达情 况的研究表明 a p o D在肿瘤和神经系统疾病患者体 内过量表达 可 以作为前列腺癌 阿尔茨海默病 精神分裂症 帕金森病等疾病 的病理标记 然而 尽管 a p o D能与多种疏水小分子物质结合 但其生理 学配体至今尚未被最终确定 其生理功能还需进一步 确定 且 a p o D与相关疾病发病机制 的研究工作 目 前几近空 白 人们是否可 以将 a p o D作为药物作用靶 点应用于临床治疗 尚需大量基础研究 工作的支持 参考文献 R e f e r e n c e s 1 R a s s a r t E e t a 1 Bi o c h i m Bi o p h y s Ac t a 2 0 0 0 1 4 8 2 1 8 5 2 T h o ma s E A e t a 1 S c h i z o p h r R e s 2 0 0 7 8 9 1 4 7 3 Ay r a u l t J a r r i e M e t a 1 Bu l l S o c Ch i m B i o l 1 9 6 3 4 5 7 0 3 适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统 使实验数据更逼真T e l 0 2 1 3 1 2 6 3 2 6 8 W WW b a o l o r c o rn 维普资讯 5 4 综述 4 Mc C o n a t h y WJ a 1 F E B S L e t t l 9 7 3 3 7 l 7 8 5 Dr a y n a D e t a 1 J B i o l C h e m l 9 8 6 2 6 1 l 6 5 3 5 6 S mi t h KM P f 口 f f d R e s l 9 9 0 3 1 9 9 5 7 P r o v o s t P R e t a 1 Mo l C f f d o c r i n o l l 9 9 5 1 0 9 2 2 5 8 P r o v o s t P R e t a 1 J L i d Re s l 9 9 0 3 1 2 0 5 7 9 S 6 g u i n D e t a 1 Mo l Br a i n R e s l 9 9 5 3 O 2 4 2 1 0 Ga n f o r n i n a MD e t a 1 De v Oy n 2 0 0 5 2 3 2 1 9 1 l 1 1 Wa n g L e t a 1 CP f f Bi o l l n t 2 0 o 7 3 l 7 4 l 2 Dr a y n a DT e t a 1 DN A l 9 8 7 6 l 9 9 1 3 Do Ca r mo S e t a 1 J B i o l C h e m 2 0 0 2 2 7 7 5 5 l 4 l 4 Ya n g CY a 1 B i o c h e mi s t r y l 9 9 4 3 3 1 2 4 5 l l 5 S k e r r a A B i o c h i m B i o p h y s Ac t a 2 0 0 o 1 4 8 2 3 3 7 l 6 B o r g h i n i I a 1 Bi o c h i m Bi o p h y s Ac t a l 9 9 5 1 2 5 5 l 9 2 l 7 Vi e i r a AV e t a 1 Mo l R e p r o d De v 1 9 9 5 4 2 4 H4 3 1 8 S i ma r d J e t a 1 E n d o c r i n o l o g y 1 9 9 2 1 3 0 l l 1 5 l 9 Do Ca r mo S e t a 1 Bi o c h i m B i o p h y s Ac t a 2 0 0 7 1 7 7 3 9 5 4 2 0 L 6 p e z Bo a d o YS 口 f J B i o l C h e m 1 9 9 6 2 7 1 3 2 l 0 5 2 l T h o ma s E A e t a 1 Mo l y c h i a t ry 2 0 0 3 8 l 6 7 2 2 Co f e r S e t a 1 Ge n e 1 9 9 6 1 7 1 2 6 l 2 3 S a I j e a n t J M e t a 1 Ar t e r i o s c l e rT h r o mbV a s cB i o f 2 0 0 3 2 3 2 1 7 2 2 4 Ha l l RE e t a 1 P r o s t a t e 2 0 o 4 5 8 l 0 3 2 5 S o i l a n d H e t a 1 C P f f 0n c o l 2 0 o 7 2 9 1 9 5 2 6 Ro j o J v 口 f Ac t a 0b s t e t G y n e c o l S c a n d 2 0 o l 8 0 l 5 8 2 7 V fi z q u e z J e t a 1 Gy n e c o l 0n c o l 2 0 0 0 7 6 3 4 0 2 8 V i z o s o F J a 1 Wo r i d J G a s t r o e n t e r o l 2 0 0 7 1 3 3 2 2 1 2 9 Mi r a n d a E e t a 1 J S u r g 0n c o l 2 0 0 3 8 3 9 9 3 0 Ho l s t o n E C I s s u e s Me n t 日P 口 f r s 2 0 0 5 2 6 l l 0 3 3 l 0r d o fi e z C e t a 1 Hi s t o l Hi s t o p a t h o l 2 0 0 6 2 1 3 6 l 3 2 Ha n s e n T e t a 1 P h a r ma c o g e n o mi c s J 2 0 0 6 6 l 2 0 3 3 W a l k e r DW a 1 C u r r Bi o l 2 0 0 6 1 6 6 7 4 S t r uc t ur e Fu nc t i o n a nd Cl i ni c a l Ap pl i c a t i o n o f t he Ap0 l i p0 pr 0 t e i n D Le i W a n g Hon g Ya n Su Yon g Fe i M i ng Zh i W e n Zh a o C o l l e g e o f L if eS c i e n c e s L u d o n g U n i v e r s i t y Y a n t a i 2 6 4 0 2 5 C h i n a De p a r t me n t o f C r i mi n o l o g i c a l T e c h n o l o g y S h a n d o n g P o l i c e C o l l e g e J i nan 2 5 0 0 1 4 C h i n a Ab s t r a c t A p o l i p o p r o t e i n D a p o D i s a 2 9 k Da g l y c o p r o t e i n t h a t w a s i n i ti a l l y i s o l a t e d f r o m h u man p l a s ma h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s fra c ti o n I t i s an a typ i c al a p o l i p o p r o t e i n an d wa s s u b s e q u e n t l y i d e n ti fi e d t o b e a me mb e r o f l i p o c ali n f a mi l y b y s t r u c t u r al an a l y s i s S e v e r a l s mall h y d r o p h o b i c mo l e c u l e s we r e i d