海水胁迫对马齿苋抗氧化及其光合生理特性的影响 初稿 马青云.doc

分类号：学校代码：11460学 号：10220906南京晓庄学院本科生毕业论文海水胁迫对马齿苋抗氧化及其光合生理特性的影响 Seawater Stress on Antioxidant purslane and Photosynthetic Physiological Characteristics所在系(院）：教师教育学院学 生 ：马青云指导教师 ：张边江 研究起止日期：二一三年九月至二一四年五月二一三年五月学位论文独创性声明本人郑重声明：1. 坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2. 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3. 本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4. 本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5. 其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：日 期：海水胁迫对马齿苋抗氧化及其光合生理特性的影响作者：马青云指导老师：张边江 摘 要：本实验以马齿苋为对象，通过模拟不同程度的海水胁迫试验，测定马齿苋在不同海水浓度下的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、细胞间co2浓度以及荧光数据。旨在探究马齿苋对海水胁迫的光合生理特性以及抗氧化酶活性的变化。本实验为盐碱滩涂植物资源开发与利用提供参考。关键词：马齿苋；海水胁迫；抗氧化酶；光合生理特性目录引言41 材料与方法51.1 实验材料51.1.1 植物材料51.1.2 实验器材及工具51.1.3 实验试剂51.2 处理方法51.2.1 植物材料的处理51.3 生理生化指标的测定51.3.1 抗氧化酶的测定51.3.2 可溶性蛋白含量的测定61.3.3 游离脯氨酸含量的测定61.3.4 可溶性糖含量的测定61.4 光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）及胞间CO2浓度（Ci）测定61.5 数据分析72 结果与分析72.1马齿苋的抗氧化酶活性72.2马齿苋的可溶性蛋白含量92.3马齿苋的游离脯氨酸含量92.4马齿苋的可溶性糖含量102.5光合速率(Pn)、蒸腾速率（Tr）气孔导度(Gs)及胞间CO2浓度(Ci)的分析102.5.1 光合速率（Pn）的分析102.5.2 蒸腾速率（Tr）的分析112.5.3 气孔导度（Gs）的分析112.5.4 胞间CO2浓度（Pn）的分析123讨论参考文献 马齿苋为马齿苋科一年生草本植物。肥厚多汁，无毛，高1030cm， 生于田野路边及庭园废墟等向阳处。国内各地均有分布。该种为药食两用植物。全草供药用，有清热利湿、解毒消肿、消炎、止渴、利尿作用；种子明目。现代研究，马齿苋还含有丰富的SL3脂肪酸及维生素A样物质。SL3脂肪酸是形成细胞膜，尤其是脑细胞膜与眼细胞膜所必需的物质；维生素A样物质能维持上皮组织如皮肤、角膜及结合膜的正常机能，参与视紫质的合成，增强视网膜感光性能，也参与体内许多氧化过程。此外，马齿苋还可作兽药和农药；嫩茎叶可作蔬菜等。盐胁迫是影响植物生长发育和农作物产量和产值的主要环境胁迫因子之一，土壤盐渍化和作物盐害是世界性的问题1。盐碱地在地球上广泛分布，面积约占陆地的25%。我国的盐碱地面积约有5亿余亩即约2700 万hm2，主要分布于长江以北的辽阔内陆地区，以及辽东半岛、渤海湾和苏北滨海狭长的地带，其中已开垦的约1亿亩；但因灌溉不当还造成了相当一部分的次生盐渍化土壤，约占耕地总面积的10%2。土壤盐渍化严重影响着农业生产。要解决这一问题,除了土壤改良技术措施外,选育抗盐的植物品种是一项具有长远经济效益的任务。因此深入研究植物的耐盐性,对减轻该地区土壤盐渍化对作物栽培的影响,扩大种植范围,提高生产力,具有积极意义3。植物在逆境条件下，细胞代谢受阻而产生大量的超氧物阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、脂质过氧化物和单线态氧，即通常所说的活性氧4，这些活性氧会对细胞质膜进行过氧化，导致膜系统损伤和细胞伤害。在受到活性氧伤害后，植物会主动或被动地调动抗氧化酶类及其它抗氧化物质来清除这些活性氧和自由基，来减缓和抵御活性氧对细胞伤害。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 植物材料马齿苋的叶片1.1.2 实验器材及工具分光光度计、离心机、分析天平、托盘天平、研钵、恒温水浴锅。1.1.3 实验试剂考马斯亮蓝G-250、50 mmolL-1 pH7.18 磷酸缓冲液、95%乙醇、85% (mv-1)磷酸、3%磺基水杨酸溶液、冰乙酸、2.5%酸性茚三酮溶液、甲苯、蒽酮乙酸乙酯、浓硫酸。浓度分别为0、5%、10%、20%、30%、50%、100%的海水溶液。1.2 处理方法1.2.1植物材料的处理供试验马齿苋为江苏野生品种收集。种子用0.1%的HgCl2消毒10min并充分冲洗，然后用蒸馏水浸泡24h后播种于盛有蛭石的周转箱中，每天浇水保持蛭石湿润，自然光照。待种子萌发后选取2对叶完全展开的幼苗移栽到装有石英砂下部有孔的塑料盆钵中。用50%Hoagland营养液浇灌，正常养护至4对叶完全展开后，选取长势一致的幼苗开始用不同浓度的海水处理，每盆定苗5株。重复7次，为期一周。1.3 生理生化指标的测定1.3.1抗氧化酶的测定SOD、POD、CAT 活性和MDA含量测定，剪取处理后叶片，立即投入液氮中贮存。0.15 g 叶片加少许PVP冰浴研磨，提取缓冲液为50 mmolL-1 pH7.18磷酸缓冲液，于4 下10000 rmin-1离心15 min，取上清液进行指标的测定。SOD活性测定按Giannopolitis等 5 的方法，以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50 %为1个酶活性单位(U)，酶活性以每克鲜样所含的酶活性单位 (Ug-1) 计。取试管先后分别加入1.5ml磷酸缓冲液（0.05molL-1，pH7.8），0.3mlL-Met（1.9399g Met用PBS定容至100ml），0.3ml NBT（0.06133g用PBS定容至100ml (避光保存)），0.3ml EDTA-Na2（0.03721g用PBS定容至1000ml），0.3ml核黄素(0.0753g用蒸馏水定容至1000ml (避光保存) )，0.05ml酶液，0.25ml蒸馏水。以加缓冲液、不照光为空白对照，照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值。POD 活性测定按Kochba等 6的方法。取两只比色杯，一只中依次加入2ml 0.1molL-1的磷酸缓冲液、1ml 0.25%愈创木酚溶液、1ml 酶液、0.1ml 0.75% H2O2溶液，迅速巅到混匀，另一只不加酶液为空白，把A470调零并开始计时，每30s 1次，连续读取3min。CAT 活性测定按张宪政等 7的方法，先后加入50ul酶液，3ml 50mmolL-1的PBS(pH7.0），0.2ml 0.3% H2O2迅速颠倒混匀，开始计时，以不加H2O2的50mmolL-1的PBS（pH7.0）为空白，把A240调零，1min后在240nm下比色，每分钟1次，连续读取5min。MDA 含量测定按Heath等8的方法测定。先后加入1ml 酶液，3ml 0.5%TBA和5%TCA，混合后在100度水浴煮沸15min，迅速冷却，10000rmin-1离心10min，用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、450nm处的吸收值。计所有测定重复3次，用SPSS软件进行统计分析。1.3.2 可溶性蛋白含量的测定取1ml酶液加入5ml蛋白试剂 (100mg 考马斯亮蓝G-250溶入50 ml 95%乙醇中，再加100ml85% (mv-1) 磷酸，混合后稀释到1L-1，过滤后备用 (呈棕色)。以1mlPH7.8磷酸缓冲液加入5ml蛋白试剂为对照，在595处比色。1.3.3游离脯氨酸含量的测定取新鲜叶片0.1g，剪碎后放入试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液 (3g磺基水杨酸定溶至100ml)，于沸水浴中提取10min，冷却至室温，取提取液2ml于试管中，再加入2ml的水，2ml的冰乙酸和4ml 2.5%酸性茚三酮溶液 (以3：2的冰乙酸和6molL-1磷酸为溶剂进行现配制) 置于沸水中显色60min，冷却后，加入4ml甲苯震荡，静置后，吸取甲苯层于520nm处比色。根据标准曲线所得的回归方程计算脯氨酸含量。1.3.4可溶性糖含量的测定取新鲜马齿苋叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g，试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。吸取样品提取液0.5mL于20mL试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，在630nm处比色。1.4光合速率(Pn)、蒸腾速率（Tr）气孔导度(Gs)及胞间CO2浓度(Ci)的测定光合气体交换分析采用英国PPSyestm公司的Ciras-2型光合测定系统测定海蓬子的净光合速率(Pn)、蒸腾速率（Tr）气孔导度(Gs)和细胞间隙CO2浓度(Ci)。测定的条件为：大气CO2浓度3605molmol-1，湿度6070%，测定光强为1000mol(m2s)-1。海蓬子的光合速率以molCO2 g-1Fwh-1表示，测定时将叶室的面积设定为1，取光适应的海蓬子幼嫩枝条，迅速放入叶室内，等光合值达到最大并稳定时记录结果，然后取出叶片称量鲜重。Pn实际值(molCO2 g-1Fwh-1)=测量值/104/叶片鲜重(g)3600；Gs实际值(mmolH2O(gh)-1)= 测量值/104/叶片鲜重(g)3600。采用扫描仪扫描测定叶面积，用Leat Data软件计算得出数据，每组处理6次重复。1.5数据分析 全部数据统计分析在 Excel2003软件上进行。2 结果与分析2.1马齿苋的抗氧化酶活性超氧化物歧化酶（SOD）是生物防御活性氧毒害的保护酶之一。SOD以氧自由基为底物，在活性氧代谢中处于重要地位，可淬灭超氧负离子O2-的毒性，终止由O2-启动的一系列自由基连锁反应造成的生物毒损伤，为生物体内最重要的清除活性氧自由基的酶类。 植物在逆境下遭受伤害(或衰老)与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化物最重要的产物之一，作为细胞膜损伤程度大小的生理指标，它的含量的多少可代表膜损伤的严重程度。伴随O2-含量的增加，生物膜脂质过氧化加剧，膜脂质过氧化产物MDA含量增加。MDA能强烈地与细胞内的各种物质发反应，MDA的积累能引起细胞膜的严重损伤。因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。由图2可以看出，马齿苋的MDA含量都随着海水浓度的升高而增加，说明随着海水浓度的升高，细胞膜脂过氧化程度增高，细胞膜受到的伤害更严重。图1 不同海水浓度下马齿苋的SOD的活性图 2 不同海水浓度下马齿苋的MDA含量过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解成氧和水，在此过程中起传递电子的作用，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力的大小。逆境胁迫下，细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定，而CAT能把光呼吸、线粒体电子传递以及脂肪酸的氧化等过程中产生的H2O2分解为H2O和O2，从而清除H2O2维护膜的稳定性，从而使细胞免于遭受过氧化氢的伤害。抗逆性强的品种有较高的过氧化氢酶活性，与抗逆性呈显著性相关。图 3 不同海水浓度下马齿苋的CAT活性过氧化物酶（POD）是呼吸系统中的一种酶，广泛存在于植物的器官中（叶中尤为丰富）。它与呼吸作用，光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度。POD属非特异性酶，担任着O2-、H2O2的产生和 H2O2 的清除双重角色。由图4显示，马齿苋的POD含量都随着海水浓度的升高而增加，说明随着海水浓度的升高，POD酶的抗氧化能力随之提高。 图 4 不同海水浓度下马齿苋的POD活性2.2马齿苋的可溶性蛋白含量可溶性蛋白与调节植物细胞的渗透势有关，高含量的可溶性蛋白可帮助维持植物细胞较低的渗透势，抵抗逆境带来的胁迫。图 5 不同海水浓度下马齿苋的可溶性蛋白含量2.3马齿苋的游离脯氨含量脯氨酸（Pro）是植物蛋白质的组分之一，并可以游离状态广泛存在于植物体中，通常可以作为一种渗透调节剂或细胞质酶的保护性物质，保持细胞中生物聚合物的结构及膜的完整性。在干旱、盐渍等胁迫条件下，许多植物体内脯氨酸大量积累。积累的脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。图 6 不同海水浓度下马齿苋的游离脯氨含量2.4马齿苋的可溶性糖含量可溶性糖是干旱胁迫诱导的小分子溶质之一，其种类主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等。这些可溶性糖类参与渗透调节，并可能在维持植物蛋白质稳定方面起到重要作用。叶片中较高的可溶性糖含量既可以作为营养物质，也可以增强植物对胁迫的适应。图 7 不同海水浓度下马齿苋的可溶性糖含量2.5光合速率(Pn)、蒸腾速率（Tr）气孔导度(Gs)及胞间CO2浓度(Ci)的分析2.5.1光合速率（Pn）的分析 随着海水浓度的升高，马齿苋的净光合速率逐渐降低，当浓度达到100%时，马齿苋的净光合速率为0，说明海水浓度对于马齿苋的光合作用有着抑制作用，并且抑制作用随着浓度的升高而增加。图 8 不同海水浓度下马齿苋的净光合速率2.5.2蒸腾速率（Tr）的分析 随着海水浓度的升高，马齿苋的蒸腾速率逐渐降低，说明海水浓度对于马齿苋的蒸腾作用有着抑制作用，并且抑制作用随着浓度的升高而增加。图 9 不同海水浓度下马齿苋的蒸腾速率2.5.3气孔导度（Gs）的分析 气孔是植物叶片与外界进行气体交换的主要通道。通过气孔扩散的气体有O2、CO2和水蒸汽。植物在光下进行光合作用，经由气孔吸收CO2，所以气孔必须张开，但气孔开张又不可避免地发生蒸腾作用，气孔可以根据环境条件的变化来调节自己开度的大小而使植物在损失水分较少的条件下获取最多的CO2。气孔开度对蒸腾有着直接的影响。从图10中可以看出，在0-30%阶段，随着海水浓度的增长，气孔导度呈现下降状态，不利于光合作用中二氧化碳的吸收。而当海水浓度达到50%以后，气孔导度基本不再下降。图 10 不同海水浓度下马齿苋的气孔导度2.5.4胞间CO2浓度（Gs）的分析 从图11中可以看出，随着海水浓度的增长，细胞间的CO2浓度也呈现出增长的趋势与图8的净光合速率刚好呈相反的状态，光合速率增加对CO2利用升高，胞间CO2浓度就会减少，相反光合速率对CO2利用减少，胞间CO2浓度就会增加。因此可以推断，胞间CO2浓度从侧面反映了光合作用，一定程度上显示了净光合速率的大小。总之，随着海水浓度的变化，胞间CO2浓度与净光合速率呈相反的变化趋势，净光合速率与胞间CO2浓度成负相关。图