实验二氨基酸的荧光激发.doc

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量一.实验目的学习荧光分析法的基本原理和LS55B发光分析仪的操作。二.实验原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。 在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。 酪氨酸(Tyr)、色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。三.实验仪器和试剂1. LS-55型发光谱仪;2. 移液枪(德国BRAND公司生产);3. 50ml容量瓶，25ml容量瓶10支;4. 氨基酸储备液：色氨酸4mg/l，苯丙氨酸100mg/l;5. PH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液6. 去离子水;四.实验步骤1打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在50ml容量瓶中配置溶液，各加入缓冲溶液2ml，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l, 苯丙氨酸5mg/l；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。发射光谱参数：扫描波长范围250600nm；Ex=258nm，扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm, 扣除空白后记录信息，记住取文件名。激发光谱参数：扫描波长范围200-400nm，(Phe)=287nm，(Try)=357nm, 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm, 扣除空白后记录信息。同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm, (-)=60nm,扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm,扣除空白后记录信息。五数据处理1用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱。2从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。六讨论与思考1对待测溶液进行预扫描的有何作用？2观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？3同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。4通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。 苯丙氨酸 色氨酸5比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。 注意事项：实验报告以电子版的形式