七氟醚复合硬膜外阻滞对兔急性缺氧时肺组织超微结构与肺泡表面活性物质的影响.doc

七氟醚复合硬膜外阻滞对兔急性缺氧时肺组织超微结构与肺泡表面活性物质的影响王丽珺 仓静* 薛张纲【摘要】目的 观察七氟醚复合硬膜外阻滞对兔缺氧时肺组织超微结构与肺泡表面活性物质的影响。方法 健康新西兰大白兔28只，平均每只体质量大于2kg。随机分为4组（n=7）：对照组（C组）、缺氧组（H组）、七氟醚组（S组）与硬膜外复合七氟醚组（ES组）。ES组硬膜外导管首剂注入1%利多卡因3mg/kg，此后每小时追加该剂量。麻醉后气管插管，机械通气。H组、S组与ES组吸入14%的氮氧混合气体，直至PaO2/FiO2300，急性肺损伤（ALI）模型建立。3h后恢复自主呼吸，吸入21的氧气，并于自主呼吸（T0）,模型建立后15min、30min、1h、2h、3h与恢复自主呼吸后（T1-6）测PaO2。C组始终吸21的氧气，并于相应时点测PaO2。实验结束后立即处死动物，开胸取肺。进行支气管肺泡灌洗，取肺泡灌洗液离心后上清夜-70保存，以测总磷脂(TPL)、饱与卵磷脂(DSPC)及总蛋白(TP)含量，肺组织分别送光镜与电镜检测。结果 H组、S组与ES组均于缺氧15min后建立ALI模型。H组、S组与ES组的SatPC/TPL及SatPC/TP显著降低（P0.05）。S组的SatPC/TP低于H组及ES组、SatPC/TPL低于ES组（P0.05）。与ES组相比，H组与S组肺泡II型上皮细胞肿胀明显，板层体减少，并呈大量空泡化。结论 七氟醚通过影响肺泡II型上皮细胞板层小体，使急性缺氧性肺损伤时肺泡表面活性物质减少，复合硬膜外阻滞能在一定程度上改善肺组织超微结构的破坏。【关键词】麻醉，硬膜外； 七氟醚； 肺泡表面活性物质Effects of combined sevoflurane-thoracic epidural anesthesia on ultrastrocture of the lung and pulmonary surfactant during acute hypoxia in rabbits WANG Lijun, CANG Jin, Xue Zhanggang*. Department of Anesthesiology, Zhongshan Hospital, Medical Center of Fudan University, Shanghai 200032Abstract Objective To evaluate the effects of combined sevoflurane-thoracic epidural anesthesia on ultrastrocture of the lung and pulmonary surfactant during acute hypoxia in rabbits. Methods Twenty-eight New Zealand white rabbits of either sex, weighing above 2kg were randomly divided into 4 groups with 7 animals in each group:control group(Group C), hypoxia group(Group G), sevoflurane group(Group S)and combined sevoflurane-epidural anesthesia group(Group ES). In Group ES, The catheter was inserted at T5 ,6 interspace and advanced 1 cm into the epidural space cephalad. 1% lidocaine was injected after the epidural block was confirmed by epidurography ,followed by injection the same dose every one hour. The rabbits were anesthetized with 30mg/kg pentobarbital by IV infusion and tracheotomized and intubated，then they were mechanically ventilated( Group H, S and ES: FiO2 =14% , Group C: FiO2 =21%, VT= 1012 ml/kg , RR = 25bpm ,IE = 12) . The acute lung injure (ALI)models were considered to have been induced successfully after PaO2/FiO2300. 3 hours after reaching the ALI standard, all animals recover spontaneous breathing(FiO2 =21%). Arterial bloodgases were measured during spontaneous breathing (T0)(baseline),at 15min ,30min ,1h ,2 h , 3h after ALI was induced and recover spontaneous breathing(T1-6) in group H, S and ES and at the corresponding mechanically ventilation time in group C. Bronchoalveolar lavage Fluid (BALF) were harvested for total phosholipid(TPL), saturated phosphatidylcholine(SatPC) and total protein(TP) measurement. light microscope and transmission electron microscope were also examined. Results Compared with control group, SatPC/TPL and SatPC/TP were decreased in Group H, S and ES(P 0.05). SatPC/ TP in Group S was significantly less than those in Group H and ES(P 0.05) while SatPC/TPL in Group S was less than in Group ES(P 0.05). In Group H and S, the alveolar was congestion and edema. The alveolar type II cells were swelling and the lamellar bodies were less than other groups no matter in numbers or the alveolar surfactant within them. The alveolar structure was better in Group ES than Group H and S. Conclusions Sevoflurane reduces the pulmonary surfactant during acute hypoxia. Combined sevoflurane-thoracic epidural anesthesia can improve it. Key words Anesthesia,epidural; Sevoflurane; Pulmonary surfactant机体遭受严重创伤、感染、休克等打击后常发生急性肺损伤(acute lung injury, ALI)。急性缺氧是引起ALI的重要病因之一，开胸手术时，单肺通气造成一侧肺萎陷，使ALI的发生率增加。七氟醚麻醉复合硬膜外阻滞是目前胸科手术常用的麻醉方式，但其对缺氧时肺组织超微结构以及肺泡表面活性物质的影响，目前仍不明确，本研究就此进行了探讨。1 资料与方法1.1 实验动物与分组：新西兰大白兔28只，雌雄不拘，体重大于2kg。随机分为4组，每组7只：对照组（C组）、缺氧组（H组）、七氟醚组（S组）与硬膜外复合七氟醚组（ES组）。1.2 实验方法：30mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后，ES组先进行硬膜外置管，各组动物气管切开插管，分离右颈动脉并置管，连接生物信号处理系统（复旦大学上海医学院生理与病理生理学系研制，信号SMUP-E）。注射维库溴铵0.06mg/kg后，各组动物均连接ALC-V8动物呼吸机（上海奥尔科技生物技术有限公司），设置呼吸频率25次/min，潮气量1012mL/kg，吸呼比为1：2，维持呼气末二氧化碳分压为3040mmHg，吸入氧浓度为21%。30min后，H组、S组与ES组吸入氧浓度为14%的氮氧混合气体，S组与ES组同时吸入七氟醚1MAC，缺氧3h后再吸入21%氧浓度的气体，并恢复自主呼吸。急性肺损伤模型建立后15min、30min、1h、2h、3h与恢复自主呼吸后(T1-6)抽颈动脉血1mL做血气分析，对照组于自主呼吸(T0)、机械通气相应时间点与恢复自主呼吸时（T1-6）做血气分析。实验过程中持续输入0.9% 氯化钠溶液10mLkg-1h-1,间断追加维库溴铵0.06mg/kg。 实验结束后立即处死动物，开胸取肺，自颈动脉处负压抽血，直至不能抽出为止。取出左、右肺，迅速取一块肺组织置于冷冻液中（2%戊二醛，0），在冷固定液中将肺切成若干12 mm3大小的标本块，数块标本放置在装有冷固定液的小瓶中，抽真空，置4冰箱内3 h，取出肺标本用1%四氧化锇固定，再行乙醇、丙酮系列逐级脱水，环氧树脂618包埋，切片，行醋酸铀、枸橼酸铅双染色，备电镜观察。随机取小块肺组织置于4%福尔马林中，两周内行脱水、石蜡包埋，制成切片与HE染色，光镜下观察肺内的病理变化。两肺用37 0.9NaC1溶液1520 mL/kg进行支气管肺灌洗，反复3次，收集的肺泡灌洗液用两层无菌纱布过滤后余下的以1800RPM离心10min，并将分离出来的上清液置-70保存，待测总磷脂(TPL)、饱与卵磷脂(DSPC)及总蛋白(TP)含量(应用Lowry氏法、Bartlett与Mason氏法)。1.3 缺氧性肺损伤模型制备：兔气管切开插管后，接动物呼吸机机械通气，吸入低氧气体（14%O2+5%CO281%N2）,采用Detex-Ohmeda气体分析仪监测呼气末CO2压力与吸入气体氧浓度，每5min抽右颈动脉血1mL,做血气分析，直至达到PaO2/FiO2300，作为急性肺损伤的建立。1.4 硬膜外置管模型的建立1：30 mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后,左侧卧位。以T5-6椎间隙为中点， 行硬膜外穿刺并向头端置管1cm，反复抽吸无血液及脑脊液，造影确定硬膜外导管位置。首剂给予1%利多卡因3mg/kg，此后每小时追加1%利多卡因3mg/kg(图1)。1.5 统计学处理：所有数据采用Spss11.5软件处理，计量资料以均数标准差表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 4组动物体重、性别比较差异无统计学意义。2.2 4组动物自主呼吸时PaO2没有统计学差异。H组、S组与ES组在缺氧15min后均达到急性肺损伤标准，且在整个缺氧过程中均符合急性肺损伤的标准。T1-T5时间，H组、S组与ES组的 PaO2较C组均显著降低。ES组T1时的PaO2显著高于S组。恢复自主呼吸后，各组PaO2没有显著性差异。4组动物相应时点的PaO2见表1。2.3 与对照组相比，缺氧组、七氟醚组与复合组的SatPC/TPL及SatPC/TP均显著降低（P0.05）。七氟醚组的SatPC/TP低于缺氧组及复合组、SatPC/TPL低于复合组（P0.05）(表2)。2.4 病理形态学观察大体标本观察：缺氧组、七氟醚组与复合组多数肺组织标本呈充血、水肿变化。局部有大小不等暗红色片状改变与梗死出血灶，其切面可见不规则暗红区并能挤出泡沫样液体。对照组标本肉眼观察改变不明显。光镜下观察：缺氧组与七氟醚组肺泡壁血管明显扩张、充血,部分肺泡腔内见渗出。支气管上皮细胞呈片状脱落，肺间质水肿伴大量的中性粒细胞浸润。肺泡间隔增宽、部分肺泡萎陷、肺间质充血水肿明显，肺泡II型上皮细胞损伤。硬膜外复合七氟醚组肺泡结构尚可，未见肺泡萎陷，中性粒细胞浸润较前两组少。透射电镜下观察：各组兔肺泡II型细胞的切面呈圆形、椭圆形或多边形。细胞膜上有微绒毛凸起。细胞内可见胞核、线粒体及特征性的板层小体。环肺泡腔壁有表面活性物质内衬，呈现为电子密度稍高的界面层，肺泡腔内偶见晶格状结构，系尚未及铺敷开的表面活性物质；并见巨噬细胞。缺氧组与七氟醚组可见肺泡II型上皮细胞肿胀，微绒毛破坏程度较对照组严重，微绒毛变短、减少、部分消失，硬膜外复合七氟醚组的变化不明显。七氟醚组的板层体较对照组减少，并成大量空泡化。硬膜外复合七氟醚组的板层小体减少不明显。表1 4组动物各时点的PaO2变化（n=7） （mmHg）T0T1T2T3T4T5T6对照组115.439.784.518.8101.220.7106.319.9121.59.2122.730.1117.929.8缺氧组115.729.229.54.427.68.630.58.930.49.432.84.1134.832.3七氟醚组94.111.6253.329.41.534.24.134.12.932.33.5123.817.7复合组86.16.133.36.7*34.56.3233.24.938.75.239.23.5127.223.9P 0.05 compared with Group C at the same time ；*P 0.05 compared with Group S at the same time表2 4组动物肺泡表面活性物质的比较（n=7）SatPC/TPLSatPC/TP对照组0.620.080.670.29缺氧组0.440.140.280.11七氟醚组0.310.130.140.04复合组0.490.08*0.290.16*P 0.05 compared with Group C at the same time；P0.05 compared with Group H at the same time*P 0.05 compared with Group S at the same time (放大倍数：120%) （分辨率：512168）图1 兔硬膜外造影图象 图2 对照组肺组织HE染色200 图3 缺氧组肺组织HE染色200 图4 缺氧组肺组织HE染色400 图5 七氟醚组肺组织HE染色200 图6 七氟醚组肺组织HE染色400 图7 硬膜外复合七氟醚组肺组织 HE染色200图8 硬膜外复合七氟醚组肺组织HE染色400图9 缺氧3h后七氟醚组肿胀的肺泡 图10 七氟醚组的板层小体（透射电镜 18000） II型上皮细胞（透射电镜 18000） 图11 对照组的板层小体 图12 硬膜外复合七氟醚组的板（透射电镜 18000） 层小体（透射电镜 18000）3 讨 论肺泡表面活性物质(PS) 是由磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等极性磷脂与少量蛋白质、碳水化合物、胆固醇等组成的复合物，磷脂酰胆碱是其主要组成成分。PS主要来源于肺泡II型上皮细胞，一般认为, PS经降低肺泡液张力而发挥其维持细胞稳定性、增加肺顺应性及保持肺泡相对“干燥”等生理作用。PS还在肺防御保护中起重要作用,是肺中特有的生理性抗损伤因子之一。肺泡表面活性物质在维持正常呼吸功能中也具有独特的生理效应。有研究表明，吸入性全身麻醉药对肺泡表面活性物质有直接的影响。有资料认为，吸入脂溶性全身麻醉药引起肺泡表面张力增高，吸入非脂溶性全身麻醉药后肺泡表面张力不变，其差异与肺泡内表面活性物质的变化有关2,3。国内实验结果表明，在吸入非脂溶性麻醉药后，肺泡II型上皮细胞能及时分泌表面活性物质，增加其在肺泡腔表面的含量，从而代偿了非脂溶性麻醉药升高表面张力的作用3。吸入脂溶性麻醉药后，尽管全肺组织表面活性物质含量增加，但主要滞留在细胞内,无法顺利地分泌到肺泡腔表面，造成肺泡表面张力升高。显然有某种因素干扰了II型细胞的分泌，我们认为，这个因素很可能就是脂溶性的吸入性全身性麻醉药。资料表明，吸入脂溶性麻醉药后，膜的Gibbs自由能发生改变，降低了磷脂酰胆碱从胶晶相转变为液晶相的转换温度4。这些研究有助于理解“干扰”的本质，但确切机制有待进一步探讨。吸入吸入性麻醉药后，肺泡表面活性物质的变化还表现在质的方面5。由于表面张力升高，作为主要活性成分的磷脂酰胆碱其释放与合成比例增加是不难理解的。目前已知，磷脂酰甘油能维持表面活性脂-蛋白复合物的结构完整，保持膜活性与膜稳定性，增加膜流动性6。因此我们认为，与磷脂酰胆碱增加一样，磷脂酰甘油的增加也是机体对吸入性全身麻醉药升高肺泡表面张力的一种代偿性防御反应。实验证实，异氟醚可以降低肺泡型上皮细胞Na+-K+-ATP酶活性，尤其在过氧化环境中可加重肺泡型上皮细胞的损伤7。但由于肺泡表面活性物质本身具有抗氧化损伤的功能，因此在一定程度上可以抵消这种损伤。Verbrugg等8证实，肺泡灌洗液中嘌呤类代谢产物浓度可作为判断肺损伤的指标。为修正肺泡灌洗液对PS稀释程度不同所致的偏差，我们采取SatPC/TPL与SatPC/TP比值作为判断PS活性水平的指标。结果表明，与对照组相比，缺氧组、七氟醚组与复合组的SatPC/TPL及SatPC/TP均显著降低，一定程度上也证实了缺氧性急性肺损伤模型的成功建立。七氟醚组的SatPC/TP低于缺氧组及复合组、SatPC/TPL低于复合组，提示七氟醚使肺泡表面活性物质减少，与文献报道一致。此后的电镜结果也解释了该现象产生的原因。 宋嘉振4等的动物实验表明，吸入全身麻醉药后，肺泡II型细胞超微结构中最显著的变化在板层体。板层体是肺泡表面活性物质的储存池，板层体数量与体积的变化反映了细胞内表面活性物质的消长动态。吸入非脂溶性麻醉药后，板层体的“胞吐”现象十分活跃，而体积密度与数量密度基本不变，说明肺泡II型细胞合成与分泌表面活性物质的功能没有受到明显影响。吸入脂溶性麻醉药后，板层体的“胞吐”现象极少见，而体积密度与数量密度显著增加；这种形态学的表现说明，肺泡II型细胞合成表面活性物质的功能良好，但分泌功能受到干扰，表面活性物质被滞留在细胞内。形态学的证据与定量试验的结果完全吻合。我们的研究结果发现，在透射电镜下可见各组兔肺泡II型细胞的切面呈圆形、椭圆形或多边形。细胞膜上有微绒毛凸起。细胞内可见胞核、线粒体及特征性的板层小体，部分细胞有丰富的内质网。环肺泡腔壁有表面活性物质内衬，呈现为电子密度稍高的界面层，肺泡腔内偶见晶格状结构，系尚未及铺敷开的表面活性物质；并见巨噬细胞。缺氧组与七氟醚组可见肺泡II型上皮细胞肿胀，微绒毛破坏程度严重，微绒毛变短、减少、部分消失，复合组的变化不明显。七氟醚组的板层体较少，并成大量空泡化。复合组的板层小体减少不明显。提示七氟醚对肺泡II型细胞的影响主要表现在板层体上。综上所述，七氟醚通过影响肺泡II型上皮细胞板层小体，使急性缺氧性肺损伤时肺泡表面活性物质减少，复合硬膜外阻滞能在一定程度上改善肺组织超微结构的破坏。参考文献1 石英 陈萍. 家兔持续硬膜外治疗模型的建立J. 国际麻醉学与复杂志, 2007, 28 (1): 35-36.2 Evans JA, Hamilton RW, Kuenzig MC, et al. Effects of anesthetic agents on surface properties of dipalmitoyllecithin: l