程景 实习报告 定稿(1).doc

专业实习总结动物科技学院 动医071班 17号 程景一、实习的基本概况 我于2011年3月1日至2011年5月20日在山西农业大学动物科技学院兽医临床实验室实习，期间由李宏全老师担任实习指导教师。在这段时间里，我参与了实验室的一些日常工作，培养了自己的动手能力，还帮忙其它实验的完成，培养自己的科学思维，同时在老师的指导下完成了毕业论文，掌握了论文的写作模式、方法和思路。二、实习感受（一）成绩与收获1、对PCR的了解PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种体外酶促合成特异DNA片段的专用仪器，在人工合成引物介导下反复进行热变形-退火-延伸而扩增DNA的循环过程。因其具有特异性强，灵敏度高，对标本的纯度要求低，简便、快速等特点， PCR技术迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用。PCR方法模仿体内DNA复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，即将模板DNA置于9495的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；然后使引物模板退火，将反应体系的温度降低到4565左右，引物能分别与变性后的两条模板链碱基互补配对；将反应体系调整到DNA聚合酶作用的最适温度，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA即以指数方式扩增。1988年耐热的TaqDNA聚合酶在栖热水生菌中被分离出来后，PCR技术逐步成熟起来。近年来，在实际工作和运用中，以基本原理为基础又发展出了很多新型的PCR技术。如：反向 PCR( Inverse PCR)用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列；不对称 PCR( Asymmetric PCR)通过在反应体系中加入不等量的一对引物从而获得单链产物；重组 PCR ( Recombinant PCR)可以把两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR法。除此之外还有套式引物 PCR ( Nested Primer PCR)、免疫 PCR( Immuno - PCR)、复合PCR( Multiplex PCR)、锚定 PCR( Anchored PCR)、玻片 PCR (Slide - PCR)、加端PCR (Add - PCR)、捕捉PCR (Capture PCR)、任意引物 PCR (Arbitrarily Primer PCR)、等位基因特异性PCR (Allele - specific PCR)、原位PCR ( In situ PCR) 等。逆转录PCR( Reverse Transcription PCR,简称RT - PCR)。逆转录PCR是一种能检测细胞内低丰度特异性RNA的方法。其原理是原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR主要用于对表达信息进行检测或定量，分析基因的转录水平。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或克隆cDNA而不必构建cDNA文库。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。2、对红细胞免疫的了解 以往认为，红细胞只参与呼吸功能，没有免疫功能。事实上，红细胞有许多与免疫有关的物质，如CR1、CR3、CD58、CD59、DAF、SOD，数目众多，自成系统。红细胞是血循环中最重要的固有免疫细胞。红细胞有识别、黏附、浓缩、杀伤抗原、清楚循环免疫复合物的能力，参与机体免疫调控，并有完整的自我调控系统，许多疾病免疫发病机制中，红细胞天然免疫缺陷占有很重要的地位。已有越来越多的研究证实红细胞天然免疫功能的变化与许多疾病的发生、发展及病理过程密切相关，尤其是E-CR1基因多态性分布及其表达变化与许多疾病的发生发展关系密切，如自身免疫性疾病、传染病、血液病等。20世纪50年代，Nelson等首次发现了红细胞具有免疫黏附功能，此功能有促进白细胞吞噬的作用。人红细胞能与特异调理过的梅毒螺旋体及肺炎球菌结合，从而推测红细胞膜存在兔免疫黏附受体，免疫复合物同该受体结合，促进白细胞对其的吞噬，是宿主防御机制的一部分。20世纪60年代证实了这种人红细胞所具有的免疫黏附功能是通过型补体受体（CR1）实现的；20世纪70年代在人的红细胞膜上首次分离并纯化了该受体；20世纪80年代初，Siegel等首次提出了红细胞免疫系统的新概念。红细胞作为天然免疫的一个构成部分，是机体自身免疫平衡的稳定的重要基础，它在整体免疫反应这种具有以下作用。增强吞噬作用；清楚循环免疫复合物；识别和携带抗原；免疫调节作用；效应细胞的作用。3、试验用动物的取样以及血液的前期处理耳缘静脉采血4ml于含有EDTA抗凝剂的一次性真空采血管中，置于4备用；取出血液加入等体积（4ml）的生理盐水对犬的血细胞进行等体积稀释；按1:3比例加入红细胞裂解液，轻柔的颠倒混匀3-6次，4静置10分钟；2000rpm，4离心5分钟，弃上清加入4ml生理盐水悬浮沉淀，按1:2的比例将此悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液表面，注意不要使两者混合；4，2500rpm离心15分钟；离心后，该液分为四层，取第二层环状乳白色细胞层于另一新EP管中；4，3000rpm离心5分钟，弃上清。4、RNA的提取向EP管中的细胞沉淀加入1ml Trizol；旋涡振荡器上充分混匀，静置5min；再加入200l氯仿，混匀后静置2min，于4，13,000rpm离心15min；小心吸取上清（大约500l）与另一个干净的EP中；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后静置10min，于4，13,000rpm离心10min；倒掉异丙醇加入1ml 70%预冷的酒精洗掉多余的异丙醇，于4，10,500rpm离心5min；倒掉酒精将提取的RNA风干，约10分钟左右至半透明（不可全干）；加入40l的RNase free dH2O，充分溶解，-80保存备用。 4、论文的完成 这个假期在老师的指导下，在师兄师姐们的斑竹下，完成了我的毕业论文犬的红细胞免疫粘附受体基因克隆与序列分析，在完成的过程中，学到了许多东西，如应该选什么样的话题来做论文，选好话题以后又应该如何安排思路，安排好思路以后下笔成文又该如何查找资料，以及如何挑选资料等等，这些东西都必须是通过自己亲自完成才可以学到的。（二）问题与不足 通过这段时间的实习，发现了自己的许多的问题，三、总结在这个实习期内，我深深的感受到所学知识的肤浅和在实际运用中的专业知识的匮乏，也知道了自己不了解相关学科的研究动态，不了解学科内的科学体系，不了解学科的发展历史等，更反映出自己在处理问题的方法与策略的不足，总是浪费了时间也做不好事，让时间悄悄流失。刚开始的一段时间里，对一些工作感到无从下手，茫然不知道所措，这让我感到非常的难过。虽不能苛求在不到一百天内把发现的问题全部解决，但发现了问题总归有了一个良好的转折，在今后的工作、生活、学习中努力的方向也明确了，对自己的要求也更趋向于理性、客观。但是经过对这一个月的的实践和实习，我有了更加明确的目标，我将努力做到以下几点：1、继续学习，不断提升理论素养。在信息时代，学习是不断地汲取新信息，获得事业进步的动力。作为一名学生更应该把学习作为保持工作积极性的重要途径。 2、努力实践，自觉进行角色转化。“理论是灰色的，生活之树常青”，只有将理论付诸于实践才能实现理论自身的价值，也只有将理论付诸于实践才能使理论得以检验。同样，一个人的价值也是通过实践活动来实现的，也只有通过实践才能锻炼人的品质，彰现人的意志。3、提高学习积极性和主动性。在今后的学习和生活中，我将继续努力，深入实践，不断提升