FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)中文说明书.pdf

FastStart Universal SYBR Green Master ROX 注意 使用指南 简易版 在实际使用时请查阅 式英文说明书 1 产品概述产品概述产品概述产品概述 产品 述产品 述产品 述产品 述 FastStart Universal SYBR Green Master ROX 即用型 2 浓度的反 混和液 产品包含了基于 SYBR Green I 检测模式的 qPCR 和两 法 qRT PCR 进行实时 DNA 检测时所需的所 试剂 除了引物 模板 试剂内含参比染料 ROX 适用 于所 需要 ROX 校 的实时荧 定 PCR 储存条储存条储存条储存条件 稳定性件 稳定性件 稳定性件 稳定性 产品在 15 25 C 条件 稳定存放至标签 的 效期之前 若存放于 2 8 C 条件 则 短期储存 超过 1 个 注意 请将 产品避 保存 请避免将 产品反复冻融 反 液添加引物 模板 在 15 25 C 避 条件 稳定储存 24 小 时 产品用 冰运输 2 产品使用方法产品使用方法产品使用方法产品使用方法 2 1 实验前准备实验前准备实验前准备实验前准备 实验最佳反 条件 包括 DNA 模板和 PCR 引物浓度 孵育温度和时间 循 次数 据特异性模板 引物而异 本准备 本准备 本准备 本准备 请使用纯度 浓度 优化摸索且 含 PCR 抑制物的 DNA 模板 如 基因组学或 粒 DNA cDNA 获得高重复性的 酸分离产物 请使用以 试剂 MagNA Pure LC 或 MagNA Pure Compact 系统结合系统配套的 酸分离 试剂 用于 酸自动分离 手动分离请使用 High Pure Nucleic Acid Isolation Kit 更多 细信息 请阅读罗氏 用 学部生化产品目录 或 罗氏 用 学 部 页 www roche applied 请使用至多 250 ng 基因组 DNA 或 50 ng cDNA 请将 DNA 模板储存于 PCR 别的水中或 5 10 mM 的 Tris HCl pH 7 5 8 0 中 由于 EDTA 镁离子会形 敖合物 故请避免将模板溶解于 TE 缓 液 引物引物引物引物 PCR 引物的最终浓度 0 1 0 4 M 建议初次试验时 种引物的浓度 0 3 M 注意 实验中使用的引物对浓度相等 PCR 引物的 定了扩增子长度 熔解温度 扩增效率 产 引物 时也 于 PCR 程序的选择 两 法 法 引物 通过实时 PCR 系统供 商 如 PrimerExpress 提供的相关 程序 或者您 以在网 获 相 的信息 如 Primer3 http frodo wi mit edu 如果您想在 续实验中用水解探针检测您的实验结果 请选择熔解温度 Tm 在 58 60 C 之间的引物 您也 以采用罗氏 用 学部通用探针 提供 的预测试的探针来进行验证 SYBR Green I 检测 通用探针 的探针相对 的 PCR 引物的 请参考在线 ProbeFinder 软件 阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照 了检测 DNA 污染物 在阴性对照组中将 DNA 模板替换 PCR 别的水 反 体 反 体 反 体 反 体 FastStart Universal SYBR Green Master ROX 适用于多种 体 的反 体 系 反 中使用的反 管 板 合适的反 液体 请参考 仪器供 商的建 议 内参染料内参染料内参染料内参染料 ROX 原则 实时 PCR 系统 除 LightCycler 系统外 提供了两种 的检测方法 结合内参染料 通常 ROX 的检测来校 各管 SYBR Green I 荧 信号 单独检测 SYBR Green I 荧 信号 检测方法的选择 于所用仪器 如 是否 检测内参染料荧 信号的通道 仪 器 源 卤素灯或激 含 ROX 内参染料的 FastStart Universal SYBR Green Master 被证实无需调整 ROX 的浓度即 用于 ABI 仪器 ABI PRISM 7000 测序系统 ABI 7300 实时 PCR 系统 ABI 7500 实时 PCR 系统 ABI 7700 测序系统以 ABI PRISM 7900 HT 快速实时 PCR 系统 也 用于 Stratagene Mx3000P QPCR 系统 注意 如果您 使用实时 PCR 系统的参比通道或您的系统 配备参比通道 请选 择 FastStart SYBR Green Master without ROX 如果您使用 Bio Rad iCycler iQ5 实时 PCR 检测系统 请选择 Universal SYBR Green Master without ROX 并参考 Bio Rad iCycler iQ5 实时 PCR 检测系统指 导手 进行 External Well Factor Plate 骤以检测孔道因子 2 2 实验 骤实验 骤实验 骤实验 骤 PCR 反 液的准备反 液的准备反 液的准备反 液的准备 以 操作 50 l 反 体系 如使用 他体系请作相 修改 骤 骤 骤 骤 操作操作操作操作 了使试剂最大程度地保证实验结果 在打开之前 将 融解 并于微型 离心机 轻微离心 用移液枪吹打混匀溶液 冰 保存 注意 如果您使用的是 5 ml 或 50 ml 瓶装的 FastStart Universal SYBR Green Master ROX 请将小瓶 翻转数次 请勿剧烈摇动 准备 100 浓度的 PCR 引物溶液 30 M 将反 管置于冰 在 50 l 的单个 PCR 反 体系中 依次加入 表中的反 液组分 试剂试剂试剂试剂 体 体 体 体 最终浓度最终浓度最终浓度最终浓度 FastStart Universal SYBR Green Master ROX 25 0 l 1 向引物 30 M 0 5 l 300 nM 反向引物 30 M 0 5 l 300 nM 水 PCR 等 19 0 l 总体 总体 总体 总体 45 l 注意 如果需要准备多次反 PCR 混合液 请将 述各组分体 按照 z 倍做 准备 z 反 数 1 用移液枪将混合液小心混匀 请勿漩涡 移 45 l PCR 混合液至 PCR 反 管或 PCR 微板孔中 于您的实时 PCR 系统 加入 5 l DNA 模板 超过 250 ng 基因组 DNA 或 50 ng cDNA 注意 在初次试验中 了获得 cDNA 模板的最优模板 将未 稀释 1 10 稀释 1 100 稀释的 cDNA 模板进行 行对照实验 用移液枪小心混匀 据仪器的指导手 处理 PCR 管或 PCR 微板 如 使用透 的 PCR 管盖 或用自 箔封 PCR 板 PCR PCR 扩增程序 很多种 两 法 法都能产生比较理想的实验结果 如 采用两 法 选择长度较短的扩增子 150 bp 且退火延长温度 60 C 如 型的 PCR 反 95 C 形 15s 60 C 条件 退火并延长 1 分钟 通常完 40 个循 了得到最佳结果 请确认所使用的仪器已校准过 并将实时 PCR 循 仪中检测 通道 置在 SYBR Green 或 FAM 如 530nm 表 标准 PCR 流程的例子 注意 如果您使用配 FastPlate 的 ABI 系统 如 ABI 7500 快速实时 PCR 系统 或 ABI PRISM 7900 HT 快速实时 PCR 系统 进行 20 l 反 体系的快速 qPCR 流 程 请 据括号中的提示进行操作 循 时间 至 1 小时 请参考您的仪器供 商提供的操作手 并 据以 参数进行操作 循 数循 数循 数循 数 分析模式分析模式分析模式分析模式 目标温度目标温度目标温度目标温度 持续持续持续持续时间时间时间时间 备注备注备注备注 1 选 无 50 C 2 分钟 如果反 液中加入了 UNG 酶以防 交 污染 1 无 95 C 10 分钟 激活 FastStart Taq DNA 聚合酶 无 95 C 15 10 40 定 据引物而 定 型 60 30 扩增 实时分析 58 60 C 快速 qPCR 的持续时间 将 PCR 管或 PCR 板放进仪器开始反 在反 结束 据仪器的定 熔解曲线分析操作指南进行结果分析 2 3 相关 骤相关 骤相关 骤相关 骤 防 防 防 防 交 交 交 交 污染污染污染污染 UNG 酶 防 PCR 过程中的交 污染 技术过程包括在扩增中加入脱氧尿苷 磷酸 dUTP 进行产物扩增 在以 的扩增反 中加入 UNG 并进行高温预处 理 如果在 面的 PCR 反 液中出 含 dUTP 的前次扩增污染物 UNG 会将 污染物降解 从而失去被 扩增的能力而无法 PCR 模板 由于目标 DNA 含 dUTP 因 UNG 影响 dUTP 是 FastStart Universal SYBR Green Master ROX 中的 分 注意 防 交 污染的 骤需要用到 LightCycler Uracil DNA Glycosylase 50 l PCR 反 加入 1 25 2 5 U 两 法两 法两 法两 法 RT PCR FastStart Universal SYBR Green Master ROX 也 用于两 法 RT PCR 在两 法 RT PCR 中 RNA 反转录 cDNA 是 在实时 PCR 仪器 进行的独立于 它 反 的 骤 利用 cDNA 作 起始 本材料来进行 续的扩增 在线 测需 据 实时 PCR 标准流程操作 们建议您使用 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 进行 RNA 的反转录 cDNA 合 的 体操作请参考相关说明书 3 相关产品 信息相关产品 信息相关产品 信息相关产品 信息 产品 产品 产品 产品 包装包装包装包装 目录号目录号目录号目录号 FastStart SYBR Green Master 4 1 25 ml 10 5 ml 04 673 484 001 04 673 492 001 FastStart Universal Probe Master ROX 2 1 25 ml 10 1 25 ml 10 5 ml 1 50 ml 04 913 949 001 04 913 957 001 04 914 058 001 04 914 066 001 FastStart TaqMan Probe Master 2 1 25 ml 10 1 25 ml 10 5 ml 04 673 409 001 04 673 417 001 04 673 433 001 FastStart TaqMan Probe Master ROX 2 5 ml 2 1 25 ml 12 5 ml 10 1 25 ml 50 ml 10 5 ml 04 673 450 001 04 673 468 001 04 673 476 001 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 50 reactions including 10 control reactions 100 reactions 200 reactions 04 379 012 001 04 896 866 001 04 897 030 001 LightCycler U