中华肿瘤投稿版肺炎衣原体感染在H.doc

肺炎衣原体感染在HEp-2细胞黏附和迁移中的作用基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30971225); 教育部科学技术研究重点项目 (206008); 教育部留学回国人员科研启动基金（2005年）作者单位：300070 天津，天津医科大学基础医学院病理生理学教研室通信作者：张丽莙，Email: 张利军 洪莉 陈宁 沈炳玲 邓艳秋 权伟 王蓓蓓 张丽莙【摘要】 目的 观察肺炎衣原体（C.pn）感染在人喉癌细胞系（HEp-2）细胞黏附和迁移中的作用，以期阐明C.pn感染在肿瘤转移中的作用及机制。方法 C.pn增殖培养后感染HEp-2细胞, 光镜下观察细胞病变，吖啶橙染色观察细胞内C.pn包涵体的形态特点，透射电镜观察C.pn包涵体超微结构。细胞黏附实验观察C.pn感染对HEp-2细胞黏附能力的影响。创伤修复实验和Transwell实验检测C.pn感染HEp-2细胞后，细胞迁移能力的改变。结果 C.pn感染HEp-2细胞72 h后，细胞内的空泡状结构即包涵体几乎占据整个胞浆。吖啶橙染色结果显示，细胞内的包涵体呈黄绿色葡萄串状。透射电镜观察到包涵体内成熟的梨形原体（EB）明显增多，而圆形的网状体（RB）则较少。细胞黏附实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞2 h后，C.pn感染组黏附细胞的吸光度（A）值0.6690.011，明显高于对照组的0.5580.005（P0.001），C.pn感染组的细胞黏附率为119.89%。创伤修复实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞24 h后，细胞向划痕中央迁移的距离明显长于对照组（P0.05）。Transwell实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞12 h后，C.pn感染组的细胞迁移数目明显多于对照组（P0.001）。结论 C.pn感染能增强HEp-2细胞的黏附能力，同时还能促进HEp-2细胞迁移，提示C.pn感染可能在喉癌转移过程中起促进作用。【主题词】 喉肿瘤；肺炎衣原体；细胞黏附；细胞迁移；肿瘤转移Role of Chlamydia pneumoniae infection in HEp-2 cell adhesion and migration ZHANG Li-jun, HONG Li, CHEN Ning, SHEN Bing-ling, DENG Yan-qiu, QUAN Wei, WANG Bei-bei, ZHANG Li-jun. Department of Pathophysiology, Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaCorresponding author：Zhang Li-jun, E-mail: 【Abstract】 Objective To observe the effect of Chlamydia pneumoniae (C.pn) infection on human epidermoid carcinoma-2（HEp-2) cell adhesion and migration, to further clarify the role and mechanism of C.pn infection in tumor metastasis. Methods HEp-2 cells were infected with C.pn after the culture and propagation of C.pn. Cytopathic effect was observed with a microscope. Morphological characteristics of C.pn inclusions in HEp-2 cells were examined under fluorescence microscope by acridine orange staining. The ultrastructural changes of C.pn inclusions in HEp-2 cells were investigated by transmission electron microscope (TEM). Cell adhesion assay was performed to investigate the effect of C.pn infection on the adhesion of HEp-2 cells to collagen. The wound-healing assay and Transwell assay was performed to explore the effect of C.pn infection on HEp-2 cell migration. Results At 72 h post-infection, C.pn infected-HEp-2 cells were swollen and partially desquamated. Numerous vacuoles termed the inclusion were observed and C.pn inclusions occupied almost the whole cytoplasm under the light microscope. The grape-like C.pn inclusions were observed in HEp-2 cells under fluorescence microscope by acridine orange staining at 72 h after infection. Under TEM, there were more mature pear-shaped elementary bodies, but less larger and round reticulate bodies in HEp-2 cells infected with C.pn for 72 h. In the cell adhesion assay, the A value in C.pn infection group is 0.6690.011, which was far higher than that in the control group (0.5580.005) at 2 h after infection. There was significant statistical difference (P0.001). The cell adhesion ratio in C.pn infection group is 119.89%. The migration distance of C.pn infected-HEp-2 cells was significantly longer than that of control cells at 24 h after infection in the wound-healing assay (P0.05). HEp-2 cells infected with C.pn for 12 h were found to migrate more than the control cells in the Transwell assay (P0.001). Conclusion C.pn infection can significantly promote the HEp-2 cell adhesion to collagenand migration of HEp-2 cells, indicating that C.pn infection may play an important role in promoting the metastasis of laryngeal cancer.【Subject words】 Laryngeal neoplasms; Chlamydia pneumonia; Cell adhesion; Cell migration; Neoplasm metastasis喉癌是临床上常见的恶性肿瘤，在头颈外科恶性肿瘤中发病率仅次于鼻咽癌、上颌窦癌。近年来，喉癌在我国的发病率正日益攀升，一般认为这与吸烟、酗酒、长期吸入有害物质、乳头状瘤病毒感染及环境污染等因素有关。研究发现，肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，C.pn）感染与肺癌1-2、喉癌3-4等肿瘤密切相关，但在这些研究中，C.pn感染被认为是一种促使肿瘤发生的危险因素，至于其在肿瘤发展和转移中的作用尚不清楚。而转移正是喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因。但癌细胞转移是一个复杂而有序的多步骤、多环节、多因素参与的生物学过程。整个过程受多种因素的调控。其中，癌细胞的黏附和迁移能力是决定其侵袭性和转移性的关键因素之一5-6。C.pn感染可促进单核细胞、中性粒细胞7-8等细胞迁移。但是，C.pn感染对人喉癌细胞系（human epidermoid carcinoma-2，HEp-2）细胞黏附和迁移能力的影响，目前不甚明确。因此，本研究拟用C.pn感染HEp-2细胞，观察HEp-2细胞黏附和迁移能力的改变，探讨C.pn感染在HEp-2细胞黏附和迁移中的作用，为研究C.pn感染在喉癌转移中的作用奠定基础，为肿瘤的防治提供新思路。材料与方法1. 细胞株、菌种及主要试剂：HEp-2细胞购自协和医科大学细胞库，C.pn AR-39购自美国标准菌库（ATCC 53592），DMEM培养基购自北京天润善达生物科技有限公司，特级胎牛血清购自Hyclone公司，吖啶橙染料购自上海生工生物工程有限公司，型胶原购自Sigma公司，Transwell小室购自Coming公司。2. 细胞培养：HEp-2细胞用DMEM培养基培养，含10% FBS、庆大霉素10g/ml 及万古霉素25g/ml。37C、5% CO2培养箱培养。3. C.pn感染HEp-2细胞：参考相关文献9对C.pn进行增殖培养后，将C.pn悬液接种至90%融合的致密单层HEp-2细胞上，加入含10%FBS的DMEM培养基。25C、1 700 g离心50 min。37 C、5% CO2 条件下培养2 h。然后弃培养液，更换为衣原体生长液，置于 37C、5% CO2 恒温培养箱内培养72 h。 4. 吖啶橙荧光染色观察C.pn包涵体形态：C.pn感染HEp-2细胞72 h后，弃原培养液，用95%乙醇固定10 min后，PBS漂洗1次，然后加入1 g/ml的吖啶橙荧光染料，染色3 min，再用PBS漂洗1次，荧光显微镜下观察HEp-2细胞内的C.pn包涵体形态。5. 透射电镜观察C.pn包涵体超微结构：C.pn感染HEp-2细胞72 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，然后用10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，600 g离心10min，弃上清。细胞沉淀用2.5%戊二醛固定，4C过夜。然后拨离细胞团块，PBS漂洗3次，用l%四氧化锇后固定l h后，分别用50%、75%、90%和无水乙醇梯度脱水。环氧树脂包埋、固化和修块后，制备半薄切片。醋酸铀和柠檬酸铅染色后，透射电镜观察HEp-2细胞内的C.pn包涵体超微结构。6. 细胞黏附实验：接种至24孔板的HEp-2细胞生长至90%融合时，用含1%FBS的DMEM同步化处理12 h，弃培养液，D-hanks 清洗2次。将感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37C、5%CO2 培养箱孵育2 h。然后以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用含0.1% BSA的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为6104 个/ml，分别接种到已用型胶原包被的96孔板内，每组设4个复孔。37C、5%CO2 培养箱孵育1 h。弃培养液，每孔加入50 l 0.5 mg/ml MTT，37C培养4 h。弃上清，每孔加DMSO 100 l并振荡10 min，在波长为 570 nm 处测定每孔吸光度（A）值，测定细胞黏附能力。计算细胞黏附率=感染组A值/对照组A值100%。7. 创伤修复实验： HEp-2细胞接种至24孔板内，达到 90%融合后行同步化处理12h，弃培养液，D-hanks清洗2次。将MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37C、5%CO2培养箱孵育2 h。用无菌的移液管尖在各组孔内行直线划痕，造成“伤口”，用D-hanks小心清洗脱落的细胞， 37C、5%CO2 培养箱培养24 h。应用软件（Image-ProPlus，version 4.5.1）测量HEp-2细胞迁移距离。8. Transwell实验： HEp-2细胞同步化处理12 h后，用MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37C、5%CO2 培养箱孵育2 h。之后以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2106个/ml。然后向Transwell下室中加入0.6 ml含20% FBS的DMEM培养基，上室加入细胞悬液100l，常规孵育12h。室温下甲醇固定10 min，Giemsa染色15 min，显微镜下每孔随机选取5个视野，计算平均穿膜细胞数。9. 统计学方法： 实验数据采用统计学软件SPSS11.5进行分析，结果数据以s表示，组间差异采用t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。结 果1. C.pn成功感染HEp-2细胞 在倒置相差显微镜下，正常HEp-2细胞呈梭形，胞浆丰富，折光性强（见图 1a）；C.pn感染HEp-2细胞后，细胞肿胀，折光性差，随着感染时间延长细胞脱落逐渐增多。细胞内出现空泡，即包涵体，如箭头所示（见图 1b）；感染72 h后，包涵体几乎占据整个胞浆，在一个细胞内可观察到多个包涵体（见图1b）。吖啶橙染色后，在荧光显微镜下可观察到，C.pn感染HEp-2细胞72 h后，细胞核与核仁清晰可见，胞浆内充满葡萄状包涵体，成团成簇，呈黄绿色（见图 1c）。为进一步观察C.pn包涵体的形态特征，我们应用透射电镜观察了C.pn感染HEp-2细胞72 h后的包涵体超微结构（见图1d）：包涵体体积较大，细胞核因被挤压而变形。包涵体内成熟的原体（elementary body，EB，见图1d实线箭头所示）明显增多，其特征是梨形的高电子密度物质（深黑色）被一多形细胞膜包绕，之间的低电子密度物质（灰白色）是壁膜间隙；网状体（reticulate body，RB，见图1d虚线箭头所示）则较少，特点是圆形的低电子密度物质被细胞膜包绕，壁膜间隙不明显。2. C.pn感染增强HEp-2细胞的黏附能力 用MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞2h后，细胞黏附于型胶原的能力明显增强。C.pn感染组黏附细胞的A值为0.6690.011，明显高于对照组的0.5580.005，其差异有统计学意义（P0.001），计算C.pn感染组的细胞粘率为119.89%（见表1及图2）。3. C.pn感染促进HEp-2细胞迁移 在创伤修复实验中，显微镜下可见HEp-2细胞从划痕边缘向中央移动；HEp-2细胞被C.pn感染后24 h，细胞向中央迁移的距离明显长于对照组（P0.05）（见图3a、3b、3c和3d）。为进一步证实C.pn感染在HEp-2细胞迁移中的作用，我们又进行了Transwell实验。结果显示，C.pn感染HEp-2细胞12 h后，C.pn感染组的细胞迁移数目明显多于对照组（P0.001）（见图4、表2和图5）。讨 论C.pn是一种严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，作为呼吸道病原体感染人类。C.pn感染在人群中非常普遍，其以两种状态存在。一是可在细胞外存活和传播，具有感染性但无增殖能力的EB；另一是在细胞内以二分裂方式增殖，具有代谢活性但无感染性的RB。EB可被易感细胞吞入胞浆并分化为具有代谢活性的RB。RB经 4872h 后又分化为EB形态，从感染的细胞内释放出来，从而进入另一个感染周期9-10。本研究用C.pn成功感染HEp-2细胞，C.pn在HEp-2细胞中可形成多个包涵体，吖啶橙染色显示包涵体呈黄绿色葡萄串状。透射电镜观察到包涵体的超微结构特点，印证了吖啶橙染色的结果。这与Wolf等在研究中，通过透射电镜所观察到C.pn包涵体的特点相一致11。C.pn感染导致肿瘤发生的机制可能有两方面：一是C.pn在人体内的长期慢性感染可能通过促进炎症细胞释放炎症介质、NO和自由基等损伤细胞基因，诱导细胞发生恶性转化12；二是C.pn可能与其它危险因素一起对肿瘤的发生起协同作用13。但C.pn感染在肿瘤侵袭和转移中的作用并不清楚。肿瘤细胞的高侵袭性和转移性与其高黏附性和运动性密切相关。研究表明，C.pn感染单核细胞或巨噬细胞后，可促进这些细胞黏附于内皮细胞14；同时，内皮细胞被C.pn感染后，E-选择素、细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1等黏附分子的表达均上调，也可促使单核细胞和中性粒细胞黏附于内皮细胞15-16。3本研究发现，HEp-2细胞被C.pn感染后，其黏附于型胶原的能力明显增强。型胶原是细胞外基质成分之一，肿瘤细胞黏附于细胞外基质，是肿瘤细胞脱离原发灶向远处转移的起始步骤17。因此，C.pn感染可能通过增强HEp-2细胞黏附于细胞外基质的能力，从而促进癌细胞向远处转移。C.pn感染与细胞迁移关系密切。C.pn可刺激血管平滑肌细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），而后者可促进单核细胞迁移18。C.pn感染内皮细胞后，刺激内皮细胞分泌白介素-8和MCP-1，从而促进单核细胞和中性粒细胞跨内皮迁移8。本研究结果显示，C.pn感染可促进HEp-2细胞迁移。另有研究发现，C.pn感染可诱导热休克蛋白60的产生，进而促进上皮细胞迁移和感染的肿瘤细胞的侵袭和转移18-19。这提示C.pn感染可能通过热休克蛋白60促进HEp-2细胞迁移，而后诱导癌细胞转移。此外，细胞迁移还与细胞的黏附性密切相关20-21。本实验中，我们发现C.pn感染能促进HEp-2细胞黏附于型胶原。因此，C.pn感染还可能通过增强HEp-2细胞黏附能力而促进其迁移，从而诱导癌细胞转移。本研究用C.pn成功感染HEp-2细胞，观察了细胞内C.pn包涵体的形态特点，发现C.pn感染可促进HEp-2细胞的黏附和迁移，为进一步阐明C.pn感染在肿瘤侵袭和转移中的作用及机制奠定基础。参 考 文 献1 Littman AJ, White E, Jackson LA, et al. Chlamydia pneumoniae infection and risk of lung cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2004, 13:1624-1630. 2 Anttila T, Koskela P, Leinonen M, et al. Chlamydia pneumoniae infection and the risk of female early-onset lung cancer. Int J Cancer, 2003, 107:681-682.3 Falck G, Gnarpe J, Hansson LO, et al. Comparison of individuals with and without specific IgA antibodies to Chlamydia pneumoniae: respiratory morbidity and the metabolic syndrome. Chest, 2002, 122:1587-1593. 4 Moutel K, Merol JC, Prevost A, et al. Prevalence of Chlamydia pneumoniae infection in squamous cell carcinoma of the head and neck. Anticancer Res, 2004, 24:1207-1210.5 Zhang L, Wang T, Wen X, et al. Effect of matrine on HeLa cell adhesion and migration. Eur J Pharmacol, 2007, 563:69-76. 6 Mazzocca A, Carloni V. The metastatic process: methodological advances and pharmacy- ological challenges. Curr Med Chem, 2009, 16:1704-1717.7 Schmidt R, Redecke V, Breitfeld Y, et al. EMMPRIN (CD 147) is a central activator of extracellular matrix degradation by Chlamydia pneumoniae-infected monocytes. Implications for plaque rupture. Thromb Haemost, 2006, 95:151-158.8 Yang X, Coriolan D, Schultz K, et al. Toll-like receptor 2 mediates persistent chemokine release by Chlamydia pneumoniae-infected vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005, 25:2308-2314.9 洪莉, 杨坤, 张利军, 等. 肺炎衣原体在HEp-2细胞中增殖的观察. 中华微生物学和免疫学杂志, 2008, 28:1121-1125.10 Dautry-Varsat A, Subtil A, Hackstadt T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol, 2005, 7: 1714-1722.11 Wolf K, Fischer E, Hackstadt T. Ultrastructural analysis of developmental events in Chlamydia pneumoniae-infected cells. Infect Immun, 2000, 68: 2379-2385.12 Rosin MP, Anwar WA, Ward AJ. Inflammation, chromosomal instability, and cancer: the schistosomiasis model. Cancer Res, 1994, 54:1929s-1933s.13 Littman AJ, Jackson LA, Vaughan TL. Chlamydia pneumoniae and lung cancer: epidem- iologic evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005, 14:773-778.14 Azenabor AA, Job G, Adedokun OO. Chlamydia pneumoniae infected macrophages exhibit enhanced plasma membrane fluidity and show increased adherence to endothelial cells. Mol Cell Biochem, 2005, 269:69-84.15 Takaoka N, Campbell LA, Lee A, et al. Chlamydia pneumoniae infection increases adherence of mouse macrophages to mouse endothelial cells in vitro and to aortas ex vivo. Infect Immun, 2008, 76:510-514. 16 Hgdahl M, Sderlund G, Kihlstrm E. Expression of chemokines and adhesion molecules in human coronary artery endothelial cells infected with Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae. APMIS, 2008, 116:1082-1088.17 Pan Y, Song QL, Lin YH, et al. GLB prevents tumor metastasis of Lewis lung carcinoma by inhibiting tumor adhesion actions. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26:881-886.18 Hirono S, Dibrov E, Hurtado C, et al. Chlamydia pneumoniae stimulates proliferation of vascular smooth mu