玻璃微电极技术及其在植物胞内测量中的应用.doc

精品文档玻璃微电极技术及其在植物胞内测量中的应用姓名：汪晓丽学号：4034导师：封克 教授扬州大学环境科学与工程学院，扬州 2250091 玻璃微电极技术简介1.1 玻璃微电极及离子选择性玻璃微电极微电极是指尖端很细的电极探针。它可以用于胞内测量18，也可以用于胞外测量9。对于细胞内测量，通常采用玻璃微电极，内部灌注盐溶液，与电极夹持器的金属接触点之间构成盐桥，从而构成电路的一部分。玻璃微电极尖端用特制仪器拉制得非常细（直径一般不超过1m），这样细的针尖刺入植物细胞膜后，质膜很快就能够在针尖刺入处愈合，从而避免细胞膜受到破坏，且容易获得一个比较稳定的膜电势差。最简单的玻璃微电极可用来测量细胞膜内外的电势差。这时需要两个电极，一个是测量电极，尖端细小，插入细胞内，另一个是参比电极，尖端稍大，安放在细胞外。两电极间的电势差由静电计测量，经放大器放大后由记录仪记录（图1）。图2双管离子选择性玻璃微电极示意图 ( from Miller A J. )图1玻璃微电极测定细胞膜电位示意图离子选择性玻璃微电极是指在尖端有一层离子选择性液膜的玻璃微电极。它对跨膜电势差和相应的敏感离子都有响应。胞内测量时，可同时测量跨膜电势差和相应离子的活度（图2）。采用离子选择性微电极进行胞内测量时主要的优点是：（1）原位测定，不会对细胞造成伤害；（2）可同时测定单个细胞的跨膜电势梯度和化学势梯度；（3）可用于测定多种离子；（4）与其它胞内测量方法相比，相对比较便宜。正是由于离子选择性微电极的这些优点，使得离子选择性电极成为测量单个细胞内离子的活度的唯一方法。采用离子选择性微电极进行胞内测量时最大的缺点是：只能测量细胞内单点的离子活度，因而在细胞内离子浓度相差很大时不能提供更为完全的信息。1.2 离子选择性玻璃微电极技术离子选择性玻璃微电极的制作是微电极技术的一个关键步骤，大体可分为拉制玻璃针、硅化玻璃管内壁、灌注离子选择性液膜、校正等几个步骤10。玻璃微电极通常采用硬质玻璃（如硼硅玻璃、铝硅玻璃）管经专门的微电极拉制仪拉制而成。硅化玻璃管内壁是为了在玻璃管内壁与离子选择性液膜之间形成高阻封接的牢固防水层。离子选择性液膜原液可以自己配制或直接购买商品化的，灌注到微电极的尖端后形成一层对于特定敏感离子有响应的选择性液膜。校正离子选择性玻璃微电极时通常采用具有不同活度的一系列标准溶液。为了尽量接近细胞内的情况，需要对标准溶液的离子强度、pH等进行调节，并且其中往往还要加入少量的干扰离子。玻璃微电极制作成功后，即可用于进行植物细胞的胞内测量。所采用的仪器设备主要有：显微镜、微操纵仪、放大器、数据采集系统、防震台和屏蔽罩等。由于生物电信号的电压极小，电阻大，所以放大器必须具备高灵敏度、高输入阻抗、高辨差率等特点，才能准确记录到电信号的微弱变化。2 玻璃微电极技术在植物细胞胞内测量中的应用2.1 研究离子跨膜转运机制细胞的膜电位是由细胞膜对特异离子的相对透性和离子的跨膜浓度梯度决定的，一般为负值。任何离子或分子在跨膜转运时，如果有电荷的移动，就会使跨膜电势差（膜电位）发生变化。当内向电流（阳离子内流或阴离子外流）大于外向电流（阳离子外流或阴离子内流）时，膜被去极化，即膜电位向负值减少的方向变化；当外向电流大于内向电流时，膜被超极化，即膜电位向膜电位负值增大的方向变化。当然，生物膜中膜电位的变动是很有限的，因为：膜电位为负值，使得一些溶质（例如：NH4+、糖类、氨基酸等）能够逆浓度梯度在电场驱动下进行跨膜运输；膜电位需控制在一定范围内才能使得H+-ATP酶能够正常地运转，否则会造成膜的电损伤；膜电位在细胞信号传导中起着重要的作用，例如，当一些效应物引起膜电位去极化时，触发Ca2+通道的激活，使得胞内的Ca2+浓度发生变化而导致信号进一步传导11。膜电位高低受到细胞外和细胞内诸多因子的影响，例如pH、细胞质ATP浓度、离子组成等。膜电位可用于表征细胞健康状况和能量状况，因为一旦细胞膜受到损伤，或者细胞内的ATP库被耗竭了，膜电位就会有大幅度的改变12。由于离子选择性电极可同时测量跨细胞膜的电势差和膜内特定离子的活度，因而可根据Nernst方程来计算特定离子跨膜运输的平衡浓度，并判断其是主动运输还是被动运输。假如测得液泡膜电势差为1020mV，利用Nernst方程可计算出通过被动运输进入液泡膜的NO3-平衡浓度可达69 mol L-1。但是，实际上液泡中的NO3-浓度要高得多，因此NO3-从细胞质中进入液泡的机制主要靠主动运输。 NH4+、NO3-、SO42-、H2PO4-、氨基酸、蔗糖等都是细胞内代谢过程的底物，它们通过跨膜运输进入细胞内的代谢库，因而其在细胞内的浓度（活度）及细胞膜上特定转运体的活性就体现了细胞内相应的代谢过程的活性12。例如，通过在外部溶液中加入NO3-和NH4+，诱导细胞的膜电位发生变化，可用于分析NO3-和NH4+转运体的活性1, 3, 7, 13。一般而言，NO3-对膜电位的影响是先快速的去极化，然后再以相对较慢的速度发生超极化或者复极化（图3）。在大麦中，去极化的程度随NO3-诱导时间的延长而增加1。大麦、拟南芥根毛细胞的膜电位发生去极化的程度随着外部溶液中NO3-浓度的增加而增加1,14，而玉米根细胞的膜电位发生超极化的程度随着外部溶液中NO3-浓度的增加而增加3。无论是去极化还是超极化，NO3-诱导的膜电位变化都符合Michaelis-Menten方程的描述，这就说明膜电位的变化与细胞膜上NO3-转移系统的活性有关。NO3-诱导细胞膜电位先发生去极化，可能是由于H+/NO3-共运引起的，后发生超极化则可能是由于H+/NO3-共运使细胞质酸化，进而激活了质膜上的质子泵3, 5。在研究硝酸根转运体基因在爪蟾卵母细胞中的表达特性时，这种假设得到证实：在爪蟾卵母细胞中，NO3-诱导细胞膜电位也发生去极化，但由于不能激活质子泵而使得细胞膜电位不能得到恢复15。NH4+诱导膜电位发生快速的去极化，去极化的程度随外部溶液中NH4+浓度的增加而增加7。低浓度NH4+诱导水稻膜电位发生去极化的程度符合Michaelis-Menten方程的描述，这就说明膜电位变化与细胞膜上NH4+转移系统的活性有关；高浓度NH4+诱导水稻膜电位发生去极化的程度随着外部溶液中NH4+浓度的增加而成线性增加（图4）7。这种膜电位去极化程度随NH4+浓度发生双阶段性变化的现象，正是由于细胞膜上存在两个NH4+转运系统，即高亲和系统（HATS）和低亲和系统（LATS）。图4 外部溶液中NH4+浓度对水稻根细胞膜电位去极化程度的影响 (from Wang MY, et al. 1994. Plant Physiol. )图3野生型拟南芥与突变体根表皮细胞膜电位随NO3-浓度的变化 (from Wang R, et al. 1996. Proc. Nart. Acad. U.S.A.)2.2 研究离子的分室化Zhen等和Miller等采用硝酸盐选择性微电极分别测定了细胞内硝酸盐活度，发现可将硝酸盐在细胞内的分布划分为以液泡膜为界的两个组群（populations）5, 6。研究表明，细胞质的NO3-浓度通常保持在某一稳定的水平上，不随外界浓度的变化发生明显的改变；液泡中NO3-浓度随外界NO3-的供给状况而变，而且可以和细胞质内的NO3-相互发生转移。Walker et al (1995)首先采用三管离子选择性微电极来确定微电极尖端在植物细胞中的定位（图5，6）8。三管离子选择性微电极就是在双管离子选择性微电极的基础上再增加一个可以指示细胞定位的微电极（如H+或Ca2+选择性电极）。由于细胞质的pH一般稳定在7.07.6，而液泡内的pH一般在4.06.016，所以H+选择性电极可用来指示微电极尖端是位于细胞质内还是液泡内（图6）。图6 三管离子选择性微电极测定大麦根细胞质K+活度与pH的分布(from Walker DJ, et al. 1995. Plant Physiol. )图5 三管离子选择性微电极测定大麦根皮层细胞质K+活度 (from Walker DJ, et al. 1995. Palnt Physiol. )3 展望测定细胞内离子的浓度（活度）是研究离子跨膜转运机制的先决条件，目前测定细胞内离子浓度的方法主要有分室示踪外流法（Compartmental trace refflux）、核磁共振法（Nuclear magnetic resonance）、细胞分级法（Cell fractionation）、离子选择性微电极法（ion-selective microelectrode）等。不同方法测得的细胞内离子浓度的值相差悬殊，但到目前为止很少有研究采用不止一种方法来研究细胞内离子的浓度，也很少有研究采用同一方法来比较不同植物的测定结果。在我国还没有有关植物液泡中硝酸盐研究的报道17，这在很大程度上也是苦于缺乏一个标准而准确的测量离子浓度的方法。离子选择性电极法是目前测定细胞内离子活度的唯一方法，且可同时测定跨膜的电势差，因而在细胞内测量方法中占有独特的地位，为研究离子的跨膜转运机制提供了有效的信息。离子选择性微电极的制作是限制其使用的一个主要因子。离子选择性液膜的导电性、选择性仍需要进一步提高。目前所使用地离子选择性电极仅限于测定H+、K+、Na+、Ca2+、NH4+等阳离子和NO3- Cl-等阴离子，新的离子选择性微电极有待研究和发现。参考文献1 Glass A D M, Shaff J E, Kochian L V. Studies of the uptake of nitrate in barley. IV. Electrophyiology. Plant Physiol.,1992,99: 456-4632 McClure P R, Kochian L V, Spanswick R M, et al. Evidence for cotransport of nitrate and protions in maize roots. I. Effects of nitrate on the membrane potential. Plant Physiol.,1990,93: 281-2893 McClure P R, Kochian L V, Spanswick R M, et al. Evidence for cotransport of nitrate and protions in maize roots. II. Measurement of NO3- and H+ fluxes with ion-selective microelectrodes. Plant Physiol., 1990, 93: 290-2944 Ullrich W R, Larsson M, Larsson C M, et al. Ammonium uptake in Lemna gibba G 1, related membrane potential changes, and inhibition of anion uptake. Physiol. Plant, 1984, 61: 369-376.5 Miller A J, Smith S J. The mechanism of nitrate transport across the tonoplast of barley root cells. Planta, 1992, 187: 554-5576 Zhen R G, Koyro H W, Leigh R A, et al. Compartmental nitrate concentrations in barley root cells measured with nitrate-selective microelectrodes and by single-cell sap sampling. Planta, 1991, 185: 3563617 Wang M Y, Glass A D M, Shaff J E. Ammonium uptake by rice roots. III. Electrophysiology. Plant Physiol., 1994, 104: 899-906.8 Walker D J, Smith S J, and Miller A J. Simultaneous measurement of intracellular pH and K+ or NO3- in barley root cells using triple-barreled, ion-selective microelectrodes. Plant Physiol., 1995, 108: 743 -7519 Henriksen G H, Bloom A J, Spanswick R M. Measurement of net fluxes of ammonium and nitrate at the surface of barley roots using ion-selective microelectrodes. Plant Physiol., 1990, 93, 271-28010 Schule W R, Kib W, Gunzel D. Ultramicroelectrodes for membrane research. Electrochimica Acta. 1997, 42: 3197-320511 吴平, 印莉萍, 张立平, 等著. 植物营养分子生理学. 北京: 科学出版社. 2001, 171-172.12 Miller A J, Cookson S J, Smith S J, et al. The use of microelectrodes to investigate compartmentation and the transport of metabolized inorganic ions in plants. J Exp Bot, 2001, 52: 541-54913 Ayling S M. The effect of ammonium ions on membrane potential and anion flux in