LH-20装填和使用说明.doc

Sephadex LH-20 装填指南 Sephadex LH20 是由葡聚糖G-25羟丙基化工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Sephadex LH20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，即可用于初步纯化步骤，也可用与最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。 制备凝胶悬浮液 装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH20而言，25100m的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底清洗。 Sephadex LH20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。 1 在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。2 使溶胀的胶体积沉淀之后占总体积的75，上层溶剂占25，这时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可移动。 3将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。 表一 干胶溶胀表 溶 剂 床体积（mL凝胶/g干胶粉末） Dinethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.44.6 Pyridine 嘧啶 4.24.4 Water 水 4.04.4 Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.84.2 Saline 生理盐水 3.94.1 Methanol 甲醇 3.84.1 Methane dichloride 二氯乙烷 3.84.1 Chloroform1 氯仿 3.84.1 Propanol 丙醇 3.74.0 Ethanol2 乙醇 3.63.9 Isobutanol 异丁醇 3.63.9 Formamide 甲酰胺 3.63.9 Methylene dichloride 二氯甲烷 3.63.9 Butanol 丁醇 3.53.8 Isopropanol 异丙醇 3.33.6 Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.33.6 Dioxane 二氧杂环乙烷 3.23.5 Acetone 丙酮 2.42.6 Acetonitrile3 乙腈 2.22.4 Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.82.2 Benzene 苯 1.62.0 Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.61.8Toluene 甲苯 1.51.61包含1的乙醇。 2包含1的苯。 3溶胀胶体积小于2.5mLg的溶剂没有使用价值。 平衡 上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。 洗脱液 为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。 样品 样品体积应该占柱总体积的1-2，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。 洗脱 洗脱流速应根据情况而定，最大线流速约12cmmin（反压1.5ba），建议流速为1-10cmh。总体来说，较低的流速，具有较高的分辨率。 再生 凝胶再生通常事先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如果换洗脱液，则需要重新平衡。 体积流速与线性流速的关系 线性流速体积流速横截面积 溶胀体积 由于Sephadex LH20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。 新体积旧体积（新柱体积旧柱体积） 胶的性质 Sephadex LH20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性再分离过程中起着重要作用。? 排阻极限 45KD（与所有溶剂有关） 上样量 吸附模式 取决于所需分辨率 分子量大小 小于总体积的20 正相分配 小于总体积的1 胶粒形状 球形，多孔 颗粒大小（干） 18111um（直径） 颗粒大小中间值（干） 70um（直径） 颗粒大小（甲醇） 27163um（直径） 颗粒大小中间值（甲醇） 103um（直径） 最大线性流速 720cmmin参考线性流速 60cmminpH的稳定性 操作中 211清洗中 213化学稳定性 在许多水溶液及有机溶剂系统中都定。在pH2以下或强氧化剂中不稳定 高压灭菌 121可忍受20分钟 操作温度 4到40 保存条件 新填料 425（干燥） 使用后填料 48，pH68，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20乙醇，0.04叠氮钠）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20使用说明1450.00/100g产品 LH-20分离范围（球蛋白） 100-4000颗粒大小（m） 20-150特性/应用 胆固醇，脂肪酸，激素，维他命，天然产物 PH稳定性 213最高流速（cm/h） 400适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶极少需要再生使用得当，分离效果可保持不变。 上样量视被分离物的结构性能的差异而定差异大，则大；差异小，则小。 凝胶过滤的上样量一般为57的床体积，我们建议初次上样量控制在12的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。 甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于6070乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的6070乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高.如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。 1. 先讲Sephadex LH-20 的原理。 Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 2.再讲Sephadex LH-20 洗脱溶剂。Sephadex LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿甲醇最为常见，先用50氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。 3.接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇水），样品用最少体积的甲醇水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进行过滤！否则把Sephadex LH-20 堵塞，就必须将Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，造成不必要的浪费）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿甲醇），样品用最少体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，湿法上样。Sephadex LH20使用心得谈：1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，使用请千万注意，很贵的哟！（当然，老板有钱就另当别论拉）2 先讲Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后，其实就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿甲醇最为常见，先用50氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇水），样品用最少体积的甲醇水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿甲醇），样品用最少体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，湿法上样。5 分离的技巧，最后说说我的使用心得（1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。（3） 馏分一定要接的细，可110，或120 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用Sephadex LH20分离黄酮类化合物经验人们对Sephadex LH20的分离原理目前还主要认为有以下有两方面：一）过滤作用，二）反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用是反向分子筛原理，大分子的化合物被筛出，先被洗脱下来，小分子的化合物保留，最后出柱。在反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还能起一个反相分配的作用，这个时候分子大小相同的化合物，极性大的那个就要被先被洗脱下来，极性小的化合物后出柱。在正相溶剂洗脱，这主要*分子筛作用来分离。Sephadex LH20在黄酮类化合物分离纯化时比较有意思，对于分离黄酮苷元类化合物，主要起作用的是吸附作用，吸附程度取决于游离酚羟基的数目，但是成苷时，分子筛就起主导作用了。在硅胶板上或聚酰胺薄层上与相对应的单个黄酮苷元几乎分不开，但是用小量氯仿比上大量甲醇混合溶剂溶解成真溶液后，上Sephadex LH20，用甲醇冲洗，很快单个的黄酮苷元就下来了，双黄酮苷元要冲洗1719个柱床体积才能下来，有黄色色带，肉眼很容易观察到。关于Sephadex LH20的梯度洗脱，大家意见也不同，这个只能自己对于自己所要分的那系列化合物试着做了，例如我在分离黄酮类化合物时基本上都是纯的甲醇，如果不行才会选用甲醇水系统，例如好多人喜欢在反相溶剂洗脱中用的是甲醇水系统。先用水，然后增加甲醇比例，最后用甲醇冲柱；正相以氯仿甲醇最为常见，起步比例氯仿甲醇（1：1），然后增加甲醇比例，最后用甲醇冲柱。其实，在Sephadex LH20使用过程中，分离技巧也是十分重要的，1） 流速要控制好，既不可过快也不可过慢，为了快加压，分子筛效果就会大大降低；过慢会导致样品在柱子扩散严重，达不到分离效果。2）柱子要长短适应（决不象有些人说的那样，越长越好，我们就两个Sephadex LH20上行为相似的黄酮苷元做过试验，相同的胶体装一根又细又长和长短合适的柱子，前者分离效果反而不好，觉得可是能流速会降低，相应的扩散也变大了）。3）每一流分一定要细接，千万不要怕麻烦，我们常115130 个保留体积一接。再提两点注意事项：1）如果黄酮类化合物粗提物中有鞣质，那么你就要小心了，Sephadex LH20对鞣质几乎是死吸附的。为了给老板省钱，最好先考虑除鞣，再用Sephadex LH20。2）上样量不要超载，使用这么长时间的Sephadex LH20了，不同种类的化合物会不同，但是整体上载样量不大，千万注意不要超载。 生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。 1.测定-分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选择-层析方法 若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。二 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。三 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。 3.纯化-大量粗品 处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。 4.纯化-硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。 5.纯水-糖类分子 固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。 6.纯化-膜蛋白 膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。 7.纯化-单抗、抗原*单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。 8.纯化-重组蛋白 重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。一 GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。2 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。二 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。 9.纯化-包涵体蛋白 包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。 10.包涵体蛋白固相复性 *近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。 *固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。 11.纯化-中草药有效成分 中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。 *生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。 *一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。 12.纯化-肽类 肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。 13.纯化-核酸、病毒 核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、 SOURCE Q分离核酸。 14.纯化-寡核苷酸 寡酸苷酸多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。 15.脱盐、小分子去除 使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。 16.疫苗纯化 使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白，处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。17.抗生素聚合物分析 中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。 18.纯化-基因治疗用病毒载体 SORRCE 15Q 19.纯化-基因治疗用质粒 QSepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。1.去除内毒素 内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。 内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。 内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。 利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL，PMB，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。 2.去除蛋白中的核酸 大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。 胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。 核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。 利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。3.去除病毒和微生物 病毒和微生物可成为病原,应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。 病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent)处理，使病毒失活，如Triton和Tween。再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白，去除S/D。 其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。阅读(17)评论(0)01-07正在加载评论.正在加载.葡聚糖凝胶绍凝胶层析的理论（分子筛理论），重点介绍Sephadex葡聚糖凝胶层析方法和试验。简介：凝胶过滤（gel filtration）技术是60年代兴起的一种简便有效的生物分离纯化方法。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，因凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻于外部，在过滤的过程中，溶液中的物质按不同分子量筛选分开，达到分离纯化的目的。这一技术又称为分子筛层析，或者称为凝胶层析。凝胶是不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能的一类化合物。目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE- Sephadex）等种类。由于凝胶过滤技术设备简单、操作方便，重复性能好和样品得率高等特点。广泛应用于生命科学领域，如蛋白质、核酸、多糖氨基酸、激素和抗生素等物质的分离纯化。凝胶层析在载脂蛋白的分离纯化中，属于使用最多的技术手段。凝胶过滤装置种类很多，其基本操作过程大同小异，操作步骤主要有：凝胶种类的选择，按被分离物的性质及分子量大小而定；凝胶柱的制备；加样与洗脱；分部收集透析，浓缩。一、基本理论（一）分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。（二）色谱柱的重要参数柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。二、凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。三、实验技术（一）层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:110:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1100:1，常用凝胶柱有5025厘米，1025厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20时约为40；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮Cl3C-C(OH)(CH3)2在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60时易引起分解而失效。乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。选择层析方法在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。脱盐、小分子去除 使用凝胶过滤介质Sephadex G10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting(5ml)可用针筒操作。HiTrap Desalting(26ml)可在数分钟为多至10 ml样品脱盐。跟大家分享，凝胶柱层析关键的一环如何选择凝胶填料作者: zhouchao2006 发布日期: 2008-03-15如何选择凝胶做分离纯化工作的人都知道，选择合适的填料是至关重要的。 1.测定-分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选择-层析方法 若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。二 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。三 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。 3.纯化-大量粗品 处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。 4.纯化-硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。 5.纯水-糖类分子 固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。 6.纯化-膜蛋白 膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。 7.纯化-单抗、抗原 *单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protei