新药研究与开发课题设计书.doc

广东医学院药学院新药研究与开发课题设 计 书项 目 名 称：维生素B1对SMMC-7721肝癌细胞作用的研究申 请 者： 钟启胜所 在 单 位： 广东医学院药学院09级邮 政 编 码： 523808通 讯 地 址： 东莞市松山湖科技产业园新城大道1号申请者电话传 真： 电 子 邮 件：990742791 申 请 日 期： 2012年 5 月 5 日广 东 医 学 院 药 学 院 二一二年 制一、简表研究项目情况名称维生素B1对SMMC-7721肝癌细胞作用的研究类别A. 自由申请项目 研究类型A. 基础研究C. 重点项目AB. 应用基础研究A申报学科名称1代码1名称2代码2申请金额0.43万元研究期限2013年1 月至2013年7 月所用实验室实验室全称实验室类别A. 国家重点B. 部门开放实验室编号C. 省重点实验室C项目组情况项目成员姓名学院、年级、班别学号联系方式项目中的分工签章钟启胜药学院09级06班0920606017515818264389实验方案及技术路线颜可立药学院08级06班0820606017415017188924研究内容及意义李日妹药学院09级06班0920606017715818254487立题依据陈丹娱药学院09级06班0920606018115818267154立题依据郑周光药学院09级06班0920606019715818254222研究目标及内容黄晓杭药学院09级06班0920606019415876976150研究计划及进展研 究 内 容 和 意 义摘 要肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，中国是乙肝大国，我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。维生素B1又称硫胺素。它的主要作用是以辅酶的方式参加糖代谢。还能抑制胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的水解。维生素B1主要用于防治维生素B1缺乏症(脚气病)，多发性神经炎，小儿麻痹后遗症以及小儿遗尿症和心肌炎等的辅助治疗。有文献表明维生素B1在抗肿瘤方面有作用，所以我们想研究其对肝癌有无治疗作用，肝癌现在已成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，所以研发出这方面的新药已迫不及待，而维生素B1有很好的前景。主题词 维生素B1 肝癌 SMMC-7721（颜可立）11二、立论依据1、研究意义原发性肝癌（primary liver cancer，PLC，以下简称肝癌）是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一，其中90为肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。在世界范围内，其发病率呈现上升的趋势。全世界每年新发现恶性肿瘤病人约635万例，其中肝癌占26万例（占恶性肿瘤的4），26万例中42.5发生在中国。中国、蒙古以及东南亚地区的发病率最高，达到98910万人。我国是肝癌大国，也是全球肝癌发病率最高的国家，在常见肿瘤中仅次于肺癌，居第二位。由于乙型肝炎病毒（HBV）感染、黄曲霉素、环境污染等问题还没有得到有效控制，我国肝癌发病率仍呈上升势头。本实验通过对维生素B对肝癌细胞的研究，希望能从中寻找到一条治疗肝癌的新路线，为广大肝癌患者带来福音。2、国内外研究现状根据国内外大量研究资料分析，认为肝癌发生的原因主要有以下几种： （1）病毒性肝炎：主要是乙型与丙型肝炎病毒感染，尤其是乙肝与乙肝病毒携带者，其原发性肝癌的发生率要比正常人高出2100倍；在肝癌的高发地区，约20的人可能是乙型肝炎或乙肝病毒携带者。 （2）黄曲霉毒素（AFT）：以黄曲霉素B为最重要的致癌物质。适宜于高温、高湿的气候环境中生长繁殖，尤其是夏季的霉变食物及谷物、饲料等，最易被黄曲霉菌污染而产生黄曲霉毒素，长期食用含此毒素的食物可诱发肝癌。（3）水源污染：饮用水质的严重污染，是肝癌发生的重要诱因之一，尤其是污染的沟水，其次为河水，井水最低。故在没有自来水设施的乡村，应提倡饮用井水。 （4)化学致癌物质：能引起肝癌的化学物质以N亚硝基化合物为主，如亚硝胺和亚硝酰胺等。此外，农药、酒精、黄樟素等亦均能诱发肝癌。 （5）其他因素：营养过剩（大量营养素）或营养缺乏（如维生素A、B1缺乏）、血色病、寄生虫感染及遗传等，也是诱发肝癌的危险因素。 （6）免疫状态：有人认为肝癌患者血浆中含有一种封闭因子，能抑制细胞免疫并保护肝癌细胞不受免疫细胞杀伤。现已证明，甲胎蛋白（AFP）就能抑制淋巴细胞和巨噬细胞的吞噬作用。（7）基因突变：近年来，还有人认为，环境中的突变原和病毒作用激发肝细胞分裂反应途径的活化，引起细胞的点突变和基因易位，是加速癌细胞增殖的可能因素。 此外，肝癌的发生还与非血蛋白的核蛋白对细胞周期的调控失常，以及细胞内外因素如环核苷酸、激素、多肽、生长因子及多胺等有关。 目前肝癌的治疗方法有手术治疗，动脉化疗栓塞，经皮消融疗法，肝移植和全身化疗。全身化疗采用单药或联合化疗，常用药物主要有5氟脲嘧啶、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉索、顺铂、卡铂等。但其有效率均在 1020，效果不令人满意。 化疗进展的重要标志是有新的、对肿瘤细胞杀伤力强的药物上市，从而提高治疗效果改变患者的预后，延长生命。 肝癌容易转移，因此，不少肝癌在诊断时就发生了转移 ，无法完全切除肿瘤，或者 ，即便是手术切除了肿瘤 ，但手术后很快就复发或发生了转移。这就说明肝癌其实是一种全身性的疾病，也说明全身药物治疗的重要性。 迄今为止，几乎所有问世的化疗药物都应用于肝癌，但有效率很低，几乎没有超过2O。而且，从延长病人的生存期而言，尚没有一种传统的化疗药物有确凿的证据表明能延长肝癌病人的生存期。原 因之一在于肝癌本身对化疗药物比较不敏感，不像血液系统肿瘤那样对化疗药物敏感。原因之二是传统的化疗药物选择性差，只要是增生快的组织都容易受到化疗药物的损害。因此寻找一种安全有效的治疗药物是当今研究的热点。最近，权威学术期刊英国癌症杂志刊登了一项在加拿大开展的大规模女性癌症筛查及长期追踪项目，显示B族维生素可调控肿瘤风险。B族维生素是一个“大家庭”，虽都归为B族，但奇怪的是，它们很多成员的通俗名称并不含“维生素B”。原来科学家们最初在米糠中发现了抗脚气病因子，并称之为维生素B，后来随着研究的进展，发现以前命名的维生素B其实是一族物质，因此将它们称为“B族维生素”，并沿用至今。 “加拿大女性癌症大型筛查研究人员发现，随着维生素B1(硫胺素)摄入量的提高，直肠癌和结肠癌的发病风险有下降的趋势。分析结果显示：相比每天摄入硫胺素低于1.06毫克的受访者，每天摄入1.43毫克硫胺素的受访者患上直肠癌、结肠癌的风险约降低22。早前一项波兰的研究也显示：随着硫胺素的摄入量由低于0.81毫克日增加到1.17毫克日以上(注：但要求不超过加拿大的推荐安全摄入量)，直肠癌、结肠癌的患病风险下降了86。这项波兰研究的数据同时还显示，充足的维生素A、维生素C、维生素E及类胡萝卜素均有助于降低直肠癌、结肠癌的风险。随着研究的不断深入，科学家在对B族维生素健康益处的基本认知上，进一步揭示出B族维生素还参与DNA合成，保持基因组稳定性，辅助DNA修复，调节细胞的增殖和死亡等，对人类健康十分有益。据报道，硫胺素对囊肿物有一定的治疗效果。有对一例病理确诊为溶骨性骨肉瘤的患者进行同样治疗,2天内瘤块缩小一半以上,故提出硫胺素可能是骨肉瘤的病因之一,值得今后进行探讨。 根据以上这些原理我们组对硫胺素治疗肝癌进行探究。硫胺素主要是以辅酶或辅基的形式参与机体能量代谢。近年来有关两者抗氧化性能的报道日益增多，研究发现硫胺素和核黄素的缺乏可削弱机体的抗氧化能力，对心血管疾病、肿瘤、神经发生和DNA损伤等产生影响。近年来研究发现硫胺素在防止糖尿病微血管病变、高脂血症内皮损伤、肿瘤和促进神经发生等方面发挥重要作用。硫胺素作为磷酸戊糖途径限速酶转酮醇酶 (transketolase)的辅酶，可以通过激活转酮醇酶使过量的葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢，减少具有细胞毒性作用产物的生成和细胞的凋亡。硫胺素还能以磷酸酯形式参与体内众多的氧化还原反应，改善细胞的能量代谢，清除氧自由基等脂质过氧化反应产物，保护血管内皮防止微血管病变，避免辐射诱导的基因损伤，发挥抗肿瘤和抗突变的作用。 硫胺素除以磷酸化形式作为丙酮酸脱氢酶、a酮戊二酸脱氢酶和转酮醇酶的辅酶，参与机体碳水化合物和支链氨基酸的代谢外，还可以作用于翻译过程来影响基因表达。研究发现TPP能够直接与编码其合成的mRNA反应，诱导mRNA结构发生改变，减少mRNA与核糖体的结合从而阻断翻译过程，减少自身的合成来影响硫胺素功能的发挥 “。硫胺素缺乏能够损害机体的正常功能，影响细胞的增殖导致癌症和其他退行性疾病的发生。硫胺素在体外还能抑制硝基喹啉、血管紧张素诱导的DNA氧化损伤，也可能是硫胺素防治肿瘤和其它慢性退行性疾病的机制之一 。研究发现硫胺素在厌氧环境中能够抑制细胞生长，而肿瘤细胞属于厌氧细胞，因此利用这一特性放疗时加人硫胺素可能达到抑制癌细胞的效果。硫胺素可能通过保护DNA免于损伤、抑制细胞基因突变和抑制肿瘤细胞生长而发挥抗突变和抗肿瘤的作用。3、本项目的创新之处显然，我们研究的课题是针对硫胺素地老药新用，而且该实验是首次用维生素B1对肝癌进行研究，国内外未见相同或相关的报道。4、主要参考文献及出处 1龚新雷,秦叔逵.原发性肝癌的分子靶向治疗研究新进展J.临床肿瘤学杂志.2008年01期2刘秀玲,蔡美琴.硫胺素、核黄素抗氧化作用与相关疾病研究进展.国外医学卫生学分册.2008年 第35卷 05期 第282页3杨柳明,文小敏,张福君.原发性肝癌的中西医结合诊断与治疗.军事医学科学出版社.2001年6月第一版4大洋新闻.B族维生素可调控肿瘤风险.广州日报.2009年B11版 5沙士义.肝癌药物治疗的研究进展.中国基层医药.2005年06期，第760页6金伟马力 染料木黄酮对顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的增敏作用J第四军医大学学报2005，26（8），761-763：7孙元珏，赵晖，郭跃武，等.羟基喜树碱联合草酸铂治疗晚期消化道肿瘤的近期临床疗效J中华肿瘤杂志2004，26（6） ，749-752： 8夏景光，李文建，魏 巍，等3Gyy射线对不同肿瘤细胞细胞周期进程的影响J核技术，2005，28(8)：6219陈瑞铭等:人体肝癌休外细胞株(BE L一7 402) 的建立及其特征,科学通报(9):4 34-4 36,19 75。10陈瑞铭等:体外培养三个人体肝癌细胞系的建立及其特征,中国科学9(12):12 2 51 233,1 979（陈丹娱，李日妹）三、研究方案. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题1.1研究目标研究维生素B1对肝癌有无治疗作用。1.2研究内容（1）应用新生小牛血清培养SMMC-7721肝癌细胞株，获得对数期的细胞。（2）探讨不同浓度的维生素B1溶液对SMMC-7721肝癌细胞的影响，从而确定合适的药用浓度。（3）应用Hoechest33258染色观察细胞核凋亡及细胞周期各期的判断。1.3关键问题是SMMC-7721肝癌细胞株的培养，用显微镜观察细胞的变化及细胞周期各期的判断。 （郑周光）. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析2.1实验材料 维生素B1(郑州蓝宇化工有限公司)；人SMMC-7721肝癌细胞株购自中国科学院上海细胞存储中心； RPMI 1640培养基（中美合资博慧斯生物医药科技有限公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所） ；MIT（北京中生瑞泰科技有限公司）； AnnexinV-FITC试剂盒（北京瑞邦兴业科技有限公司）；细胞凋亡 Hoechst染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）2.2实验方案2.2.1细胞增殖试验与光镜观察 将SMMC-7721细胞接种于含100ml/L 新生小牛血清的RPMI 1640培养基中，置50ml/L CO2 培养箱中，37 培养，每毫升培养液内加青霉素100单位,链霉素10 微克,培养液的pH 为7.27.4，SMMC-7721细胞为贴壁细胞，一般48 h换液1次，待细胞长满瓶底约80时，用025胰酶消化传代，一般按照1：3的比例，每710天传代一次，用胰蛋白酶消化对数生长期的SMMC-7721细胞，制备 成单细胞悬液。接种于加入到 96孔培养板，每孔 104个细胞，培养24h后换液。取对数生长期的细胞接种于培养瓶，贴壁后用含维生素B1 20,40,60,80，100，120mol/L液培养作用48 h。另设空白孔和对照孔，药物作用期间，用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，每种浓度平行3个复孔，分别于加药后24、48、72 h无菌条件下吸去上清，加入无血清的培养液100 uL/孔，并加入MTT 50 uL孔，继续培养4 h，吸去每孔的液体，加入维生素B1 150 UL孔，振荡器上振荡溶解510 min，以空白对照调零，应用自动酶标仪，在490 nm波长处测出各实验组的吸光度A值。以上实验重复3次。存活率=(药物实验组A平均值细胞对照组A平均值)100；抑制率()=1一存活率。2.2.2.Hoechest33258染色观察细胞核凋亡形态收集正常培养和维生素B1处理 48h后的细胞置于载玻上， 40g/L多聚甲醛在室温固定30min ，用0.01mol/L PBS（PH7.4 ）洗3 次，滴加Hoechest33258染色液，染色5min ，滴加抗荧光淬灭液于载玻片上，用盖玻片封片，用荧光显微镜观察核凋亡形态观察细胞形态的改变。2.2.3.细胞凋亡的流式定量检测 用Annexin V-FITC试剂盒进行定量检测收集正常培养和药物处理后细胞，用4 预冷的 PBS洗 2次，用100ul 结合缓冲液重新悬浮细胞，加入5ulFITC 标记的Annexin-v和10ul PI ，混匀后室温避光孵育15min ，再加400ul PBS，立即进行流式细胞定量检测，同时以不加 AnnexinV-FITC及PI 的一管作阴性对照。电镜样本制备 收集细胞，25g/L 戊二醛同定，2500r/min 离心，去上清，细胞团经10g/L 锇酸后固定、脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀一铅复染、透射电镜下观察。2.2.4 结果记录1细胞形态观察 维生素B1作用于SMMC-7721细胞24 h后，在Olympus倒置相差显微镜观察。 2细胞凋亡影响 维生素B1作用于sMMc-7721细胞48 h后，流式细胞仪测得的典型体凋亡峰。 维生素B1系列浓度的配制sMMc 721细胞的培养2.2.5技术线路：将维生素B1加入细胞培养皿中进行药物作用显微镜观察染色观察细胞凋亡流式定量检测电镜观察 （钟启胜）3. 年度研究计划及预期进展3.1加