2012年实验方案12065.doc

干旱胁迫下三种杨树嫩茎质外体空间的激素、离子、叶绿素荧光参数和气体交换参数动态变化微透析分析实验方案1激素分析1.1材料与设备1.1.1供试材料（1）苗木扦插培育（略）（2）实验材料干旱胁迫处理实验材料处理方式为:选取状态良好且长势相同的杨树盆栽苗，分为三个组每组设三个重复。第一组为对照组，处理方式为每三天浇一次透水（每次浇水量以花盆底部见水为准）；第二组为中度水分胁迫实验组，浇水量为浇透水用水量的1/10；第三组为重度水分胁迫实验组，处理方式为第一天浇透水以后不再浇水。每个组均设三个重复。三种杨树水分胁迫处理方式都相同。分别在水分处理后第2、4、6、8、10、12、14、16天和复水后第二天从不同水分胁迫处理的杨树嫩茎上部进行微透析取样分析，直到重度胁迫叶片大部分掉落后复水。本试验重复3次。每天晚上5-6点采用称重法测量土壤含水量。1.1.2实验设备、试剂（略）1.2实验方法1.2.1取样方法（1） 取样方法本实验选用美国BAsl公司的微透析仪(BAsi2701)，包括微注射泵、微透析探针（MD一2200)、进液管和出液管。探针截留分子量为30KD，管内灌流液为Mllipore一Q超纯水。探针入口连接微透析泵，出口连接微透析收集器。取样时，先连接好电源、微量注射泵、注射器、进液管、探针和出液管，开动微量注射泵，调整泵的灌流速度为1ul/min;当出液管头开始出水时，为防止微透析探针的损坏，先将硬的导引管成30一45度角插入距杨树顶端15cm左右（从上往下数3-4片成形叶处）的嫩茎部位，然后再植入探针，同时开始计时。在探针插入120min达到稳定状态后将导出管放入500ul离心管中开始定时收集透析液。为防止灌流液流失，在插入探针后立即采用牙托水(取少量自凝粉，用胶头吸管吸适量义齿基托树脂液剂搅拌，至勃糊状即可)密封探针边缘。取样的离心管放在冰盒里，收集完样液后放到四度冰箱备用，但时间不能太长，不能超过一天。（2） 体外回收率的测定在微透析取样前后分别把微透析探针插入配置的标准溶液中，稳定后收集透析液，用高效液相色谱仪分析其含量。最后利用HPLC测定取样前后透析液中各激素浓度与标准液中各激素浓度之比，也就是该探针的体外回收率。1.2.2激素分析方法（1）色谱条件Inertsil005一SP(5um，250mm4.6mm)色谱柱，流动相为:色谱甲醇和超纯水(含0.2%纯磷酸)，体积之比为60:40，柱温300C，流速0.6mL/min，检测波长210nm，进样量20ul;岛津Lc-20AB高效液相色谱仪。收集到的透析液在该色谱条件下直接进样。（2）标准溶液的配置在BioBasicInc公司购买的CA3、ABA、6-BA、IAA的标准品，准确称取标准品各5mg，置于50ml容量瓶内，用流动相定容至50mL，配制成100ug/mL的标准母液，备用。然后用母液稀释为各个激素所需配置的最终浓度，以浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，得到四种激素浓度与峰面积之间的回归方程及标准曲线。（3） 生长状况观察分别在水分胁迫处理后的第2、4、6、8、10、12、14、16 d和复水后第二天记录苗木生长情况,包括叶片的颜色、黄斑、脱落情况。1.3结果与讨论（期待中）1.3.1结果分析根据标准曲线和探针体外回收率计算样品激素浓度，采用SPSS软件和Excel软件分析处理数据。（1） 不同程度干旱胁迫对三种杨树植株形态的影响（2） 不同程度干旱胁迫下三种杨树四种内源激素的变化（3） 干旱胁迫对三种杨树内源激素间比值的影响（4） 干旱胁迫下内源激素间相关性分析1.3.2讨论2离子分析2.1材料与设备2.1.1供试材料（1）苗木扦插培育（略）（2）实验材料干旱胁迫处理（同激素分析）2.2实验方法2.2.1取样（方法同激素分析）2.2.3离子分析（1） 相对回收率的测定将微透析探针插入已知浓度的Na+、K+和Ca2+标准液(用购自国家标准物质中心的Na+、K+和Ca2+国标液配制)中,分别在1L/min下取样,每次取样之前平衡稳定30min,再取样100min,并收集透析液进行检测.测定浓度与标准液浓度之比就是体外相对回收率.本试验重复3次，假设得到的体外相对回收率为8%。汁液浓度计算公式:C=C1*10/0.08注:C是质外体汁液中某离子浓度; C1是原子吸收分光光度计测定的浓度值; 10是稀释倍数; 0.08是体外相对回收率。（2）Na+、K+和Ca2+浓度的测定将嫩茎透析液用超纯水分别稀释10倍后，采用原子吸收分光光度计（日立Z-2000）石墨法分别测定Na+、K+和 Ca2+浓度，将测定的浓度用体外相对回收率进行修正。2.3结果与讨论2.3.1结果分析根据标准曲线和探针体外回收率计算样品三种离子的浓度浓度，采用SPSS软件和Excel软件分析处理数据。2.3.2讨论3叶绿素荧光参数和光合反应参数的测定在干旱胁迫后测定激素和离子的同时，用Li-6400便携式光合仪（Li-COR，USA）的荧光叶室测定叶绿体荧光参数和气体交换参数。3.1材料与设备3.1.1供试材料（1）苗木扦插培育（略）（2）实验材料干旱胁迫处理（同上）3.2实验方法叶绿体荧光参数和气体交换参数分别在在水分胁迫处理后第0,5,10,15天和复水后第五天来进行测量。用Li-6400便携式光合仪（Li-COR，USA）的荧光叶室进行测定，直接读出初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、PS原初光能转换效率（Fv/Fm），净光合速率（Pn）， 气孔导度（Gs）， 蒸腾速率（Tr）， 胞间CO2含量（Ci）， 原始CO2含量（C0）。各杨树品种每个处理设置3次重复，测定叶绿素荧光前叶片均需暗适应20min。3.3结果与讨论4实验计划实验预定于2012年6月3日进行。具体安排见表1。表1实验计划表时间安排（从干旱胁迫处理当天开始计算，当天记为第0天。）第0天（06.03）第2、4、6天第8、10、12天第14、复水第二天实验内容处理实验材料，调试实验设备，准备实验用品，预实验。微透析取样，HPLCF和AAS分析，光合反应参数测定。微透析取样，HPLCF和AAS分析，光合反应参数测定。微透析取样，HPLCF和AAS分析，光合反应参数测定。5实验数据记录表表2实验数据记录表（激素、离子）时间第2天第4天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据激素ABAIAAGA36-BA离子Na+K+Ca2+时间第6天第8天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据激素ABAIAAGA36-BA离子Na+K+Ca2+Mg2+Cl-1时间第10天第12天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据激素ABAIAAGA36-BA离子Na+K+Ca2+Mg2+Cl-1表2续表时间第14天第16天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据激素ABAIAAGA36-BA离子Na+K+Ca2+时间复水第2天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据激素ABAIAAGA36-BA离子Na+K+Ca2+表3实验数据记录表（叶绿体荧光参数和气体交换参数）时间第0天第5天实验组1组2组3组备注1组2组3组备注123123123123123123实验数据荧光参数和气体交换参数FoFmFv/FmETRPnGsTrCiC0表3续表时间第10天