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细胞工程 学习要求 细胞工程植物次生代谢产物植物组织培养单克隆抗体技术体细胞克隆干细胞研究 引言 上一章我们介绍了基因工程 它是在分子水平上对遗传物质DNA分子进行操作 而细胞工程 cellengineering 是在细胞水平上研究 开发 利用各类生物细胞的生物工程技术 它是现代生物技术的重要组成部分 第一节细胞工程基础 一 细胞工程的概念以生物细胞为基本单位 按照人们需要和设计 在离体条件下进行培养 繁殖或人为的精细操作 使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发展或改变 从而改良品种或创造新种 加速繁育生物个体 获得有用物质的过程统称为细胞工程 目前 细胞工程的主要工作领域包括 动 植物细胞和组织培养 体细胞杂交 细胞代谢物的生产 细胞拆合与克隆等 二 细胞工程基础知识 体细胞杂交体细胞杂交 somaticcellcrossbreeding 又称细胞融合 它是指在一定的条件下 利用化学的或物理的方法 使不同来源的体细胞原生质体结合并增生或形成新生物体的过程 细胞核移植细胞核移植是细胞工程中细胞拆合的重要内容之一 它通常是借助显微操作仪 在显微条件下用微吸管把一个细胞中的细胞核吸出直接移入到另一个去核的细胞中 培养发育成无性繁殖系 显微操作仪 细胞器移植1 叶绿体移植叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器 其主要功能是进行光合作用 如果把高光效作物 如玉米 高粱 的叶绿体移植到低光效作物 如小麦 水稻等 的原生质体中 就能提高其光合效率 从而达到增产的目的 2 线粒体移植线粒体是动植物细胞中普遍存在的一种半自主的细胞器 是呼吸作用的中心 它在生物的能量转化中起重要的作用 同时也与某些性状的遗传有直接关系 线粒体的转移 可以传递遗传信息 改变受体细胞的某些遗传特征 如抗药性 雄性不育特性等 4 植物组织培养植物组织培养 tissuecultureofplant 技术即把植物的细胞 组织或器官等在无菌条件下植入到培养基上 使其在人工控制条件下进行生长和发育的技术 5 细胞克隆技术在生物学术语里 克隆是指从同一个细胞或个体以无性繁殖方式产生一群细胞或一群个体 在不发生突变的情况下 具有完全相同的遗传性状 常称无性繁殖 细胞 系 其动词指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中 即分子克隆技术 克隆的本质特征是生物个体在遗传组成上的完全一致性 三 细胞工程基本操作技术 无菌操作技术细胞培养技术细胞融合技术 洗涤室灭菌室配制室无菌操作室培养室鉴定室驯化移植室 1 植物细胞工程实验室的组成 2 基本设备 玻璃器皿和器械无菌操作设备培养设备其它设备 二 无菌操作 1 各种灭菌方法及其适用范围加压蒸汽灭菌法最常用的方法 是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的 在每平方厘米为一个大气压 即15磅时 的压力下 温度可达120 一般只要持续15 20分钟后 就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子 由于加压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物的 所以 该法只有当灭菌锅内的空气完全排尽后才能达到最佳效果 B干热灭菌法是在可保持恒温的电烘箱中进行的 又称热空气灭菌 它适用于各种耐热的玻璃空器皿 如培养皿 吸管等 和某些其它物品 如石蜡油 的灭菌 一般在160 温度下 持续一个小时 就可达到灭菌的目的 C过滤灭菌法是指将带菌的液体或气体通过一个称作滤器的装置 位杂菌受到机械的阻力而留在滤板上 从而达到除菌的目的 此法常用于不宜作湿热灭菌的培养液的除菌 其它灭菌方法 D熏蒸灭菌法E药剂灭菌法F灼烧灭菌法G照射灭菌法 A清洗玻璃器皿的清洗实验材料的清洗B灭菌 培养材料的灭菌以药剂灭菌法为主主要考虑 药剂的灭菌效果 材料对药剂的耐受力 2 无菌操作过程 培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌C接种经过表面灭菌的材料 按不同的要求 经过剪切 整理后 移植到培养基上培养的过程 1 培养基的组成无机营养 大量元素 N P K S Ca Mg微量元素 Fe Mn Cu等有机营养 碳源 蔗糖 葡萄糖 果糖氮源 氨基酸类 酰胺类活性物质 烟酸 肌醇 生物素等植物激素 生长素类 IAA NAA IBA等细胞分裂素类 激动素 玉米素等其它类 赤霉素 脱落酸 乙烯附加物类 琼脂 椰乳 水解蛋白等 三 培养基的组成及母液的配制 2 培养基母液配制 配制培养基前 为了使用方便和用量准确 常将大量元素 微量元素 铁盐 有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度大若干倍的母液 当配制培养基时 只需按预先计算好的量吸取母液稀释即可 母液应保存在冰箱中备用 保存时间不可过长 当母液出现沉淀或霉菌团时 则不能使用 第二节植物细胞工程 以植物细胞为基本单位在离体条件下进行培养 繁殖或人为的精细操作 使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变 从而改良品种或创造品种 或加速繁育植物个体或获取有用物质的过程统称为植物细胞工程 它的研究内容主要包括细胞和组织培养 细胞融合及细胞拆合等方面 主要介绍植物细胞培养和次生代谢物生产 植物细胞培养和次生代谢物生产 植物的次生代谢物质是天然药物的主要来源植物细胞的大量培养是利用植物细胞体系 通过现代生物工程手段进行工业规模生产 以获得各种产品的一门新兴的跨学科技术 首次提出从植物细胞培养物中合成天然药物的是1956年美国的Routier和Nickell 1967年Kaul和Staba采用多升发酵罐对小阿米 Ammivisnaga 进行了细胞大量培养的研究 并首次用此方法得到了药用成分呋喃色酮 Visnagin 七八十年代 植物组织培养 植物原生质体培养等各种植物培养技术与植物细胞培养技术共同发展 在培养基配方 环境条件控制 悬浮培养技术等研究方面相互借鉴 相互促进 而大规模培养技术方面 得益于微生物发酵技术的飞速发展 各种各样的反应器如气升式 气泡柱式 模式等反应器相继得到应用 使得植物细胞大量培养的研究迅速得到借鉴发展 这些年来植物细胞培养技术主要致力于高产细胞株选育方法 悬浮培养技术 多级培养和固定化细胞技术 培养工艺优化控制 生物反应器研制 下游纯化技术等方面的研究 并取得了较大进展 近几年有些技术用于植物细胞培养对提高产物含量 降低成本有一定的作用 这些技术有 1 发状根培养技术和冠瘿组织细胞培养技术 发状根和冠瘿组织在离体培养时都具有激素自主 增殖较常规细胞培养快 次生代谢物含量一般比悬浮培养细胞高 且能合成某些悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物以及能引入外源基因表达等特点 从而引起人们利用它们生产药用次生代谢物的重视 如利用桔味薄荷 Menthacitrata 冠瘿细胞生产萜烯 洋地黄 Digitalis 冠瘿细胞生产强心甙 丹参冠瘿细胞生产丹参酮 长春花冠瘿细胞生产吲哚生物碱 人参发状根培养生产人参皂甙 长春花发状根培养生产长春碱 青蒿发状根培养生产青蒿素 萝芙木发状根培养生产生物碱等等 2 两相培养技术 两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物 或者是具有吸附作用的多聚化合物 如大孔树脂等 使培养体系形成上下两相 细胞在水相中生长与合成次生物质 然后分泌出来转移到有机相中 这样不仅减少了产物的反馈抑制作用 使产物含量提高 而且通过有机相的不断回收及循环使用 有可能实现植物细胞的连续培养 使成本降低 不少植物培养细胞已成功地建立了两相培养系统 如Payne等在培养的长春花细胞中加入XAD 7大孔吸附树脂 可以使吲哚生物碱的含量提高 在培养的花菱草悬浮细胞中加入一种液体硅胶 可使血根碱的含量大大提高 大规模植物细胞培养技术经过几十年的努力研究 已取得很大的进展 有些药用植物种类已实现工业化生产 如从希腊毛地黄细胞培养物通过生物转化生产地高辛 从日本黄连细胞培养物中生产黄连碱 从人参根细胞中生产人参皂甙等 相当种类的药用植物细胞大量培养已达到中试水平 如长春花生产吲哚生物碱 丹参生产丹参酮 青蒿生产青蒿素 红豆杉生产紫杉醇 紫草生产萘醌 三七生产皂甙等等 目前大多数植物细胞大规模培养生产药物距商业化生产还有一定差距 主要是由于 1 植物细胞的生长周期长 易污染 2 植物细胞对生物反应器的设计装置要求较高 3 高产细胞株较难获得 目前据报道只有20多种植物的细胞培养物 其次生产物含量超过原植物 原因被认为是培养细胞的形态分化受到抑制 而大多数次生产物要在分化了的细胞中产生 由于以上的问题 加上与之相比 直接提取法成本很低 所以在很大程度上限制了大规模植物细胞培养技术生产药物走上商业化生产的步伐 但是 对一些不易栽培 稀少 不能或难以化学合成 有很高应用价值的药物 如紫杉醇 用这种方法开展研究进行生产还是很有商业价值的 而且从长远和环境保护的角度看 它应该有非常广阔的商业前景 4转基因植物生产药物 最近十几年来 植物基因工程取得了相当大的进展 用大肠杆菌 酵母等微生物发酵生产药用蛋白虽早已进入商品化生产的阶段 但仍有一些问题尚未得到很好解决 随着植物基因工程技术的发展和成熟 科学工作者们希望把药用蛋白的生产从微生物转向植物 因为其有以下优点 1 植物是真核生物 可在自身细胞内完成蛋白质的糖基化等后加工过程 使生产的药物更有利于人体吸收 2 微生物在生长过程中会产生毒蛋白等有害的副产品 如纯化工艺不过关 将会给服用药物者带来危险 而植物对人类无毒 许多植物可以食用 所以人们对植物药物较易接受 还可制成口服剂型 简化下游纯化工艺 这方面的工作 最早是1988年比利时PGS公司将一个神经肽 enkephelin 五肽 的编码基因转入烟草中表达成功 得到产量高达200nmol L种子的五肽神经肽 近几年来还有不少这类成果 如 美国利用植物基因工程技术生产白细胞介素2 荷兰用转基因马铃薯生产人的血清白蛋白 南朝鲜用转基因烟草和番茄来生产人的胰岛素等等 科学工作者们已成功地对多种植物进行了转基因的工作 使之生产药用蛋白 这些植物有 玉米 大豆 苜蓿 向日葵 烟草以及油菜 最近 免疫学与植物基因工程相结合的学科间研究 产生了一种新的疫苗生产方式 即口服疫苗 口服疫苗解决了常规大规模疫苗生产中常用的细胞培养系统有关的许多问题 包括发酵技术 严格的纯化和冷冻贮存 运输 免除了使用活病原体带来的风险和注射疫苗的灭菌 现BoyceThompson研究所的研究人员已成功地在马铃薯中产生可食用的霍乱疫苗 美国正在开发研究可产生治疗人类高歇氏病和费勃莱氏病的酶的烟草 现还有一种新思路 以病毒为载体在植物中生产药用蛋白 这种方法是先将目的基因插入病毒基因组中 然后把重组病毒接种到植物叶片上任其蔓延至所有叶片 外源基因则随病毒的复制而得到高水平的表达 这样的植物就成了生产蛋白质的绿色工厂 目前 这种技术还处在实验阶段 总之 利用植物基因工程方法生产药物还刚刚开始 有很大的发展空间 有科学家估计 植物生物技术的发展将改变半个多世纪以来许多新药单纯依赖化学合成的状况 把人类的医药行业带向一个新的里程碑 植物组织培养 植物组织培养是在无菌和人为控制外因的条件下 培养 研究植物组织器官 甚至进而从中分化 发育出整个植株的技术 植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性 在适宜的条件下 一个来自已分化的根 茎 叶等组织的细胞 经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株 植物组织培养的五个基本阶段 预备阶段诱导去分化阶段继代增殖阶段生根发芽阶段移栽成活阶段 植物组织培养的主要应用 快速繁殖 1 快速 采用常规的方法如分株法 一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株 但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株 2 周年生产 花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行 因条件可控 所以不受季节限制 可以全年进行连续生产 而常规的无性繁殖则受季节限制 只能在花卉生长季节进行繁殖 3 经济效益高 花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小 在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株 如按每株1元计算 每年产值上百万元 兰花工业 兰花工业 1960年法国的Morel观察到虎头兰的茎尖在无菌的培养基上能够形成扁圆形的小球体 这些小球体与幼胚发育成的原球体非常相似 故称为原球茎 在一定条件下 这些原球茎通过切割能够快速增殖 并能够再生成完整植株 由于利用这一技术 使兰花的生产可以象其它工业产品那样进行工厂化生产 故将这种生产兰花的方式称为兰花试管苗 工业 简称 兰花工业 兰花工业 的生产流程 预备阶段配制培养基 培养基的组成成份包括矿物盐 糖 维生素 铁盐 激素和有机附加物 具体成份和含量应根据花卉的种类 外植体的类别和快繁阶段来确定 外植体 以茎尖或幼叶作为外植体 灭菌 0 1 HgCl2和10 次氯酸钠两次消毒后用无菌水冲洗干净 剥取生长点 在解剖镜下无菌操作剥取茎尖 腋芽或叶原基 诱导去分化阶段将切取的茎尖接种到诱导培养基上进行暗培养 1 2个月可以分化出1至数个乳白色的原球茎 原球茎形成后切割繁殖原球茎 兰花工业 的生产流程 兰花工业 的生产流程 继代增殖阶段原球茎转入散射光下 用液体培养的方法继代后伸长形成根状茎 再对根状茎进行切割繁殖 此时用液体培养和固体培养交替进行为好 等到根状茎繁殖到一定数量后 转入到再生培养基中进行植株再生 生根成芽阶段转移到壮苗生根培养基上 要分离成单苗进行培养 移栽成活阶段已经生根的试管苗及时移栽 移栽要求通气性好的基质如蕨根 蛇木 彭化矿石等 也可先炼苗3 4天 然后将幼苗移到通风透水保湿的适宜基质中 在高湿弱光下缓苗一个星期 之后 放在摄氏温度20 25度 空气相对湿度50 左右的条件下养护 定期施肥喷药 提高试管苗成活率 兰花工业 的生产流程 植物组织培养的应用 人工种子 人工种子又称人造种子 这是细胞工程中最年轻的一项新兴技术 最初是由英国科学家于1978年提出的 他认为利用体细胞胚发生的特征 把它包埋在胶囊中 可以形成具有种子的性能 并直接在田间播种 人工种子的优点 第一 培养条件可以人为控制 具有省地省工可直接在田间播种等优点 第二 在人工种子制作中 可加入营养物质 植物生长调节剂 固氮菌 杀虫剂等 第三 用于制作人工种子的体细胞胚 可利用生物反应器大规模培养 大大提高了效率 第四 一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗 基因工程植株 均可利用人工种子技术加速用于生产 人工种子是由体细胞胚 人工胚乳和人工种皮三个部分组成 人工种子组成 人工种子存在的问题 许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚 现有的人工胚乳和种皮还不够理想 不能有效地防止微生物的腐蚀 人工种子的贮藏有待进一步完善 植物组织培养的应用 培育脱毒苗防治病害 植物的病毒病原体可通过维管束传导 因此 对无性繁殖的植物来说 一旦感染上病毒之后 就会代代相传越趋严重 在感染病毒的植株中 病毒的分布是不一致的 植物的去病毒技术 实质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0 1 0 5毫米带1 2个叶原基的茎尖作为外植体 进行微繁殖 使其培养成完整的无病毒小植株的技术 植物组织培养生产药物研究进展 植物含有很多次生代谢物 是一个药物的天然宝库 全世界四分之三的人口以植物作为治疗 预防疾病的药物来源 由于用红豆杉细胞可生产抗癌药物 紫杉醇 人们对植物组织培养技术有了重新的认识 1植物组织培养生产药物的优点 利用植物组织培养生产药物 已发展成为植物组织培养在生产应用的主流之一 这是由于植物产生的药物在微生物中很少发现 且化学合成难与天然药物竞争 仅从20世纪90年代以来的植物药用有效成分国际专利就达50多项 其中多为抗病毒 抗癌化合物 也因为药用植物由于缺乏环境保护 资源短缺及栽培技术问题等原因 使来源于植物的药物供不应求 植物组织培养比露地栽培有很多优点 四季均可生产 不受地区 季节及有害生物的影响 占地面积少 便于工厂化生产 可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节 便于筛选高产细胞株 利于生物转化 寻找新的有效药物成分 植物细胞内存在羟基化酶 氧化酶 还原酶 甲基化酶 酯化酶 糖基转移酶 糖苷酶等多种酶 植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物 能够产生原植物所没有的 甚至是至今自然界尚未发现的化合物 个体差异小 生产周期短 设备简单 能节省人力 物力等利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变 或进行脱毒 培育新品种 提高药用植物品质 保存种质资源 2组织培养产生的药物 植物组织培养能产生很多种药物 主要有苷类 生物碱 固醇类 醌类 黄酮类 蛋白质及其它生理活性物质 部分药物及来源植物如下表 C 愈伤组织S 悬浮培养细胞 3植物组织培养生产药物研究进展 3 1组织培养的药用植物来源通过组织培养成功的药用植物至少有200种 培养的药用植物从常见的到珍稀濒危植物 民族植物 如云南黑节草 延龄草 高山红景天 藏药 川西獐芽菜 莪术 水母雪莲 星花绣线菊 溪黄草 玉叶金花 辽东葱木等 从生产常用药的植物到具有抗癌 抗病毒等有效成分的植物 如红豆杉 艾 黄杨 狼毒 大戟属 长春花 米仔兰 狗牙花和香榧等 培养用的材料也有提高 开始以草木 木本或藤本植物的根 茎 叶 花 胚 果实 种子 髓 花药等组织或器官进行培养 发展到从器官诱导到愈伤组织 冠瘿组织 毛状根进行培养 再发展为细胞培养 目前还借助植物基因工程技术通过农杆菌介导的转化获得基因药用植物 利用转基因组织和器官培养生产药用成分 3 2培养技术植物组织培养技术不断提高 从固体 液体静态 悬浮培养 到深层大罐发酵 液体连续培养和细胞固定化培养等 最近人们对植物组织培养电刺激效应进行了探讨 应用诱导剂 稀土和体外胁迫等对植物组织培养产生药物成份进行了研究 在组织培养过程中也建立了一些相应的技术 如放射免疫测定法 复制平板技术 微滴试验 荧光显微镜术和高效液相色谱法 对筛选和获得高产细胞株非常重要 3 3产业化情况植物组织培养发展至今已有半个世纪 虽然人参和硬紫草的细胞培养在日本已经工业化 日本黄连 毛花毛地黄的细胞培养进行了中试 但进行大规模工业生产的植物细胞培养不多 这可能与高等植物细胞增殖速度慢 产物浓度低及大面积种植药用植物等因素有关 第三节动物细胞工程 单克隆抗体技术体细胞克隆干细胞研究 单克隆抗体技术 全称 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术目的 获得大量单一的抗体原理 每个B淋巴细胞都仅专一地产生 分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体难关 没有办法使B淋巴细胞在体外无限地分裂繁殖办法 利用癌细胞的无限增殖特性 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 单细胞培养 筛选 得到单克隆杂交瘤细胞 体细胞克隆 克隆 cloning 是英语 clone 音译 来源于希腊语 klon 原意是扦插枝条 即无性繁殖 动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程 动物克隆包括孤雌生殖 卵裂球分离与培养 胚胎分割和细胞核移植等 目前 生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种 所谓细胞核移植 是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核 经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中 重新组成胚胎并使之发育成熟的过程 细胞核移植技术 特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体 由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法 所以在一般情况下人们往往把它称为动物克隆技术 过去人们认为 细胞的分化程度越高 它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低 高度分化的高等成年动物体细胞甚至完全不具备这种基因组全能性 但是 1997年2月罗斯林 Roshilin 研究所的伊恩 维尔穆特 I Wilmut 等宣布世界首例体细胞克隆绵羊 多莉 Dolly 诞生 这一突破性进展打破了这一观念 体细胞克隆 干细胞研究 干细胞 stemcel1 研究是目前生命科学领域中最热门和最前沿的课题 所谓 干细胞 是指一种早期未分化细胞 具有自我更新 高度增殖和多向分化潜能的一类细胞 它所产生的子代细胞具有相同的基因型和表现型 目前 我们把干细胞分为