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文档简介

实验十二紫外吸收法测定核酸含量 实验目的 1 掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理 2 掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法 原理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质 最大吸收峰在260nm波长处 紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质 所有含嘌呤和嘧啶的物质 都具有吸收紫外线的特性 核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用 P 表示 P 为每升溶液中含有1mol核酸磷时的光密度 即吸光度或光吸收 RNA的 P 为7700 7800 RNA中磷的质量分数约为9 5 因此每毫升溶液中含1 0 gRNA的光密度为0 022 0 024 小牛胸腺DNA钠盐的 P 260nm pH7 为6600 含磷的质量分数为9 2 因此每毫升溶液中含1 0 gDNA钠盐的光密度为0 020 不同形式DNA紫外光密度不同 因为DNA具有双螺旋结构 当过量的酸 碱或加热使DNA变性时 则出现 P 260nm值升高的增色效应 在核苷酸量相同的情况下 P 260nm有以下关系 单核苷酸 单链DNA 双链DNA DNA变性后 双螺旋结构被破坏 碱基充分暴露 导致紫外光密度增加 还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况 变性DNA复性后 P 260nm值降低 称为减色效应 蛋白质由于含有芳香氨基酸 也能吸收紫外光 蛋白质的吸收峰在280nm 260nm处的光密度仅为核酸的1 10或更低 因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大 RNA在260nm与280nm处的光密度的比值在2 0以上 DNA在260nm与280nm处的光密度的比值为1 9左右 当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降 紫外吸收法测定核酸含量简便快速 灵敏度高 一般可达3 g ml的检测水平 操作方法 一 将样品配制成每毫升含550g的核酸溶液 与紫外分光光度计上测定260nm处的光密度值 按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值 式中OD260nm 260nm波长处的光密度值 L 比色杯的厚度 一般为1cm或0 5cm 0 024 每毫升溶液内含1 0 gRNA的光密度值 0 020 每毫升溶液内含1 0 gDNA钠盐的光密度值 二 如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸 则在测定时需加钼酸铵 过氯酸沉淀剂 沉淀除去大分子核酸 测定上清液在260nm处的光密度作为对照 具体操作如下 取两支小离心管 A管加入0 5ml样品和0 5ml蒸馏水 B管加入0 5ml样品和0 5ml钼酸铵 过氯酸沉淀剂 摇匀 在冰浴中放置30min 3000r min离心10min 从A B两管中分别吸取0 4ml上清液到两个50ml容量瓶内 定容至刻度 在紫外分光光度计上测定260nm处的光密度 式中 OD260nm A管稀释液与B管稀释液在260nm
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