微波辅助法提取蘑菇果实体多糖的最优化.doc

微波辅助法提取蘑菇果实体多糖的最优化Yuuichi Ookushi, Masahiro Sakamoto and Jun ichi Azuma京都大学农业研究生院环境科学与技术系摘要：在水溶液中利用微波辐射提取Hericium erinaceum果实体的多糖。Hericium erinaceum是一种名叫Yamabushitake的蘑菇。在本实验中，研究微波辐射的温度和时间对Hericium erinaceum多聚糖溶解性的影响。结果表明，虽然多聚糖的溶解性会随加热温度的升高而降聚，但是多聚糖的溶解持续到温度升高至200 。这个结果也表明，加长辐射的时间和升高温度对多聚糖的影响一样。比较结果得出，传统的外界加热与微波协助提取相比，后者用140 ，提取5 min与用100 ，提取6 h的结果相同。这个结论说明微波辅助在蘑菇果实提取多糖的提物时间方面有优势。关键字：微波辐射 多糖 蘑菇在古代，蘑菇有多种药理学作用，且有益于我们的健康。自从被发现有抗癌的功效之后，蘑菇就作为长生不老药而被人们所关注。在蘑菇中有一种活性成分被定义为葡聚糖的一种，并且很多研究人员也谈论了-葡聚糖的结构与其生物活动之间的关系。最近，也有一篇评论报道了-葡聚糖感觉器官在免疫方面的作用。一般从蘑菇的果实体中提取多糖是在热水中（约100 ）,搅拌果实体粉末几个小时，这个过程很费时。因此，我们研究应用微波辐射加热代替传统的水浴加热较迅速的实现提取过程。微波直接内部加热对分子的偶极旋转产生作用。因此，利用微波法我们可以更快，更均衡的加热材料。并且也实现了更高的产量和更干净的反应物。此外，这种无热量效果（也称做特殊的微波效果）也被讨论过。基于以上方法的优点，微波辐射法在各领域作为“绿色技术”倍受关注。例如:分析环境化学，有机综合，生物应用的进展和无机化学。尤其在有机综合领域，微波辐射方法由于其高效率，高产量和高选择性，使有机综合领域取得了显著的进步；在无机化学方面，只有通过微波辐射才能获得较小的综合纤金属粒子。在这种前提下，近年来应用微波辐射加热提取各种物质。例如：从鹰嘴豆中提取皂苷,从Rubiaceae植物中提取茜草色素和红紫素，这些所有的提取物都要比用常规外部加热而得到的提取物更加高效。但是用微波辐射法从各种真菌类的细胞壁中提取多糖的技术还没有出现。众所周知，在亚洲国家Hericium erinaceum的果实体是可食用的，药用的蘑菇。这种蘑菇在日本叫做Yamabushitake，和其他担子菌类的细胞一样，由-葡聚糖和其他多糖组成的细胞壁。最近，Yamabushitake在长野县已经被商业运作。但是这种蘑菇的化学性能还没有被完全开发。本实验研究微波辐射在蘑菇果实体中提取多糖的应用性，研究微波辐射的温度和时间的影响及包括-葡聚糖在内的多聚糖溶解性。材料和方法材料：柱型YMCPack Diol-120(80500 mm)用做分子量的测定，角质素粉（蟹壳），其他所有试剂都是分析纯。 粉状Hericium erinaceum果实体日本Saishin,Co.,Ltd.在使用前，在40 下用烤炉干燥原料至少48 h。 微波辅助萃取 主要研究在微波辐射法过程中，Hericium erinaceum聚合体的活动，由油脂和小分子物质组成的的杂质在生成物中去除。首先，在生成物中的油脂彻底的被两种形式的氯仿甲醇（2：1，1：1）去除。然后，残渣用70%乙醇处理除去如低聚糖和缩氨酸的小分子物质。最终物质叫做经处理后的原料，用做微波协助提取的样本。 微波协助提取选用微波炉，此微波炉是由Milestone 公司（Shelton,CT,USA）使用HPR-1000/6M技术研制而成的。Monobloc 是一种很强的转子体，可以安全的维持压力到100 bar，或者温度达到300 。2 g经过处理的原材料浸渍在300 ml蒸馏水中，并放在一个密封高压的50 ml容器中。使容器中装有样品并且把搅拌磁棒放在微波炉中，然后在搅拌的情况下对样品进行微波辐射。反映容器中的温度被一个光纤温度探测针监控。用由在WINDOWN的EASY-WAVE软件控制微波辐射。在辐射后，在打开容器前用冰浴冷却到室温。样品通过Toyo No.3滤纸过滤可溶性和不可溶性物质，然后自然蒸干可溶性物质。 微波辅助萃取条件 在所有微波辐射实验前预热2 min，以达到目标温度。1）用微波协助萃取方法在60 ，80 ，100 ，120 ，140 ，160 ，180 ，200 ，210 ，220 和230 下提取5 min。研究加热温度对可溶性多聚糖的影响。 2）微波辅助提取分别在140下提取5，10，20，40，60和120 min。来研究辐射时间对可溶性多糖的影响， 用传统外部加热提取 在100 下搅拌脱油脂和小分子量物质的生成物3 h。蒸馏和过滤后，用热水处理残留物3 h，剩余成分和提取溶液蒸干。 分析方法 用酚硫酸的方法和D-葡萄糖做标准测定碳水化合物成分。根据Saemanetal.的方法水解每个样品，单糖成分由配备CarboPac PA1柱(4250mm)和恒流电流计检波器，1 mm NaOH作为脱洗溶液，用HPAEC法来分析。使用40的YMC-Pack Diol-20柱，用支链淀粉校准标准和SEC方法来分析分子量的分布。用成分为1 nm Nacl的钠磷酸盐，PH为6.8，流速为0.6 ml/min作缓冲物。-葡聚糖用做检测。用FTIR-8600PC分光光度计测FT-IR光谱。用Chemagnetics CMX-300分光光度计测C13 CP/MAS NMP光谱，操作时为74.7 MHz。脉冲重复时间是3.2 s,偏振时间为1.5 ms，扫描范围为50 KHz，获得时间为40 ms。涉及化学转换的甲醇信号。结论及讨论 微波辅助萃取：1）加热温度对Hericium erinaceum多聚糖溶解的影响。 处理后的原料在蒸馏水中经微波辐射。研究在60230下微波辐射时间估计多糖溶解在水中的成分。大部分水溶性成分会随温度的升高而增多，在200 时获得最大提取率为57.9%（如图1）。大多数碳水化合物通过微波辐射溶解在水中，通常随温度的升高而增加，在200 下获得最大提取率为27%（如图1）。通过HPAEC对单糖的水溶性组分分析，在低温（60 20 ）微波辐射下，半乳糖成分脱洗显著，一般半乳糖的成分会随温度的升高而增加（如表1a）。通过SEC分析水溶性物质的分子量（图2），大约在180 KPa达到最大值，灵敏度随温度增加（60 160 ）而增加，在160 时下降，在220 时缩小。但在20 Kpa时达到最大值随温度增加而增强，大约在100 时变自由，减少到160 。这个结果表明提取过程中温度的最佳条件是两个不同的组合：180 Kpa，160 和20 Kpa，100 。8 图1：加热温度在微波辐射中对H.Erinaceum可溶性物质的影响在60230 下微波提取5 min，水中微波辐射的加热温度对Hericium erinaceum多聚糖溶解性的影响。代表：溶解性组分的质量，溶解性碳水化合物的质量，-葡聚糖的剩余率。根据水溶性碳水化合物的质量和-葡聚糖微波协助提取水溶性物质的含量，是通过其含有的所有可溶性物质的质量估算的剩余率，计算标准偏差（SD）（n=5）。微波协助提取水溶性物质的含量是通过其含有的所有可溶性物质的质量估算。微波协助提取碳水化合物的含量是通过其含有的所有可溶性碳水化合物的质量估算。碳水化合物成分由酚-硫酸方法检测。微波辐射后估算残渣总量中-葡聚糖的剩余率，用1,3:1,6-BETA-GLUCAN(MUSHROOM-YEAST) ASSAY KIT (Megazyme Ireland) 检测葡聚糖。图2：加热温度对可溶性组成分子量的影响在60 230 微波辐射下提取5 min。用YMC-Pack Diol-120色谱法检测，分析水溶性物质在微波辐射下的分子量。在正文中叙述了色谱条件。表1：温度对水溶性和非水溶性单糖组成的影响在60 230 下微波协助提取5 min糖总的提取率，在正文中叙述了提取条件。代表：水溶性化合物（a）,非水溶性化合物（b）。分析经过微波辐射的残渣。用HPSEC分析不溶性单糖的组成是葡萄糖，主要是-葡聚糖。-葡聚糖中的不溶性成分有益于保持人体的健康。如图1所示，在100 下残渣中未被提取的-葡聚糖不断增多，在120 获得最大收益，到140 时随着温度的增长而减少。这种现象的也可以解释形成的凝胶物和分解物的原因，我们都知道-葡聚糖在120 时的疏水凝胶是前面所提到的可得然胶。据此，-葡聚糖的水中溶解性在温度120 左右下降。如图1所示，有两类-葡聚糖，一种在水中溶解的温度是100 以下，另一种在高于140 的温度时才可以溶解。（图1，表2）说明在140 以上的温度提取碳水化合物和葡萄糖的含量快速增加。 用FT-IR光谱分析不溶性组分的结构（图3A）。残渣的色谱低温下，通过微波辐射产生的吸收峰变宽，随着温度升高峰型变尖，与crabchitin的光谱相比，这些吸收峰在1652 cm-1，1558 cm-1和1315 cm-1 处与角质素的吸收峰吻合，这是由于含有个别的氨基化合物。用C13 CP/MAS NMP光谱深入的分析不溶物的结构（图3B）。测定较高温度 C-1(104.8 ppm)，C-2(57.4ppm), C-3(75.4 ppm), C-4(84.4 ppm), C-5(77.0 ppm), C-6(60.6 ppm)，C=O(173.6 ppm),CH3 (24.6 ppm),及蟹角质素的特征。随着温度的升高FT-IR光谱分析讯号改变波峰。这是因为角质素与其他组成不一样，不能溶解在230 的水中。由于上述原因，温度在210 以上经过微波辐射的不溶性物质主要是角质素。这符合角质素是担子菌丝果实体的主要成分的报道。图3：加热温度对不溶物结构改变的影响 微波协助提取在60 230 下提取5 min。A：微波辐射下，用FT-IR光谱检测不溶性的主要成分。角质素的氨基化合物用pearsonetal描述。它们的峰值在正文中描述。B：微波辐射下，用C CP/MAS NMR光谱检测不溶性的主要成分。角质素中的碳元素用Tanneretal描述，它们的化学转换在正文中描述。代表蛋白质。图4微波在水中辐射的时间对多聚糖溶解性的影响 微波辅助提取在140 下提取520 min。表明：可溶性物质质量，水溶性碳水化合物质量；-葡聚糖的剩余率。根据可溶性碳水化合物的质量和-葡聚糖的剩余率，计算标准方差SD（n=5）。实验条件与图1描述一样。2）辐射时间对H.erinaceum多聚糖可溶性的影响 研究在140 持续辐射可溶性多取率为4.9%（如图4），在水中微波辐射的碳水化合物随辐射时间增长而增加，辐射120 min获得最大收益，收取率为21.0%。对水溶性单糖组分分析表明在微波辐射5 min半乳糖被脱洗，脱洗葡萄糖成分一般随辐射时间增长而增加（表2a）。SEC脱洗从侧表面两个最高脱洗是在180 KDa和20 KDa,随辐射时间1520 min的增长而增强，当辐射时间大于20 min时峰减小（图5）。表2：辐射时间对可溶性和非可溶性单糖的影响在140 下微波协助提取520 min，描述多糖提取，分析条件如正文所述。象征：a代表可溶性组分，b代表分子量的影响。图5：辐射时间对可溶性组分分子量的影响在140 下微波协助提取520 min，在微波辐射程中分析单糖的质量，用YMC-Pack Piol-120测定。色谱层析的条件 图6：辐射时间对可溶性物质结构改变的影响在140下微波协助提取520 min，用C13 CP/MAS NMR光谱分析不溶于水物质的组成，用Tanneretal描述角质素中的碳元素。代表蛋白质表3：对比传统提取方法与微波协助提取（140 ，5 min） 根据提取碳水化合物的质量，计算方差SD（n=5）。根据单糖组成，计算总糖含量。象征：在140 下微波协助提取5 min（a）；用100 热水浴提取6 h(b)。图7：对比微波辐射提取方法和传统方法提取物质的分子量分布通过YMC-Pack Diol-120测出色谱。层析的条件上文已经提过。代表：微波在140 水中提取5 h的提取物（a）。用100 水浴提取6 h的提取物（b）。表1：温度对水溶性和非水溶性单糖组成的影响在60 230 下微波协助提取5 min糖总的提取率，在正文中叙述了提取条件。代表：水溶性化合物（a）, 非水溶性化合物（b）分析用微波处理后的残渣。它的主要单糖成分是葡萄糖（表2b）.除辐射10 min外，辐射时间到40 min，可溶性-葡聚糖没有显著改变。随着辐射时间延长而降低（图4），辐射10 min从残渣中获得-葡聚糖最大收益的原因是狂犬病的凝胶体由葡聚糖组成，C13 CP/MAS NMR光谱分析不溶于水物质的组成，随着辐射时间的延长，碳元素的波峰具有蟹角质素波峰的特征，是在180 下微波辅助提取5 min的产物。 现在结果表明，H.erinaceum多聚