临床免疫学细胞因子测定及应用.doc

第十五章细胞因子测定及应用本章考点1.细胞因子的概述2.测定方法及应用细胞因子在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。检测这类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。第一节细胞因子的概述 （一）概念细胞因子是由免疫细胞产生的一大类能在细胞问传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。（二）共同特性（1）化学性质大都为糖蛋白。（2）细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。（3）一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。（三）类型细胞因子分类按其作用大致可分为免疫调节因子和免疫调控因子两大类。主要的细胞因子有：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化因子家族以及其他细胞因子等。1.白细胞介素：白细胞介素（IL）是指免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子，名称后加阿拉伯数字以示区别。现在已取得克隆化的基因、明确产物性质和活性的白细胞介素成员有15个IL在免疫细胞的成熟、活化、增生和免疫调节等一系列过程中均发生重要作用，此外IL还参与机体的多种生理及病理反应。（1）IL-1、IL-2的性质及生物活性1）IL-1的性质：IL-1的产生细胞：几乎所有的有核细胞均可产生IL-1，主要以巨噬细胞为主，IL-1分子有IL-1和IL-1两种不同分子形式。所有的有核细胞表面，都有IL-1受体（IL-1R），也分为IL-1R和IL-2R两类。IL-1的生物活性：局部免疫调节作用：与抗原协同作用；促进B细胞生长和分化及抗体形成；促进单核-巨噬细胞等APC的抗原递呈能力；与IL-2或干扰素协同增强NK细胞活性；吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应。全身性作用：有较强的致热源作用；对IL-1的生成具有反馈调节作用；合成和分泌大量的急性蛋白；使骨髓细胞库的中性粒细胞的释放和活化；与CFS协同促进骨髓造血祖细胞的增殖能力。2）IL-2的性质：IL-2的产生细胞：IL-2主要由T细胞（CD4+）受抗原或丝裂原刺激后合成。IL-2分子量为l5KD，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，具有一定的种属特异性。IL-2受体：T细胞，NK细胞，B细胞及单核巨噬细胞表面均可表达IL-2R。IL-2的生物活性：刺激T细胞生长；诱导细胞毒作用；促进B细胞生长分化；增强巨噬细胞抗原递呈能力、杀菌力及细胞毒性。2.干扰素（1）性质与类型：干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白，根据其产生细胞的不同分为3类：型、型、型，根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素分为2种类型：型和型。型干扰素又称抗病毒干扰素，其生物活性以抗病毒为主；型干扰素又称免疫干扰素或IFN，主要由T细胞产生，主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子。（2）诱发机制：正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素作用下才能诱使细胞产生干扰素。型干扰素的主要诱生剂是病毒及人工合成双链RNA，某些细菌和原虫感染及某些细胞因子也能诱导产生。型干扰素在免疫应答中受到抗原或丝裂原活化后由CD8+T细胞和CD4+T细胞产生，NK细胞亦可合成少量IFN。（3）生物学活性：干扰素的生物活性有较严格的种属特异性，即某一种属细胞产生的干扰素，只能作用于相同种属的细胞。主要有抗病毒作用、抗肿瘤作用、免疫调节作用。3.肿瘤坏死因子（1）性质和类型：人肿瘤坏死因子（TNF）有两种分子形式，即TNF和TNF。TNF由细菌脂多糖活化的单核巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，也称恶病质素；TNF由抗原或丝裂原刺激的淋巴细胞产生，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能，又称淋巴毒素。 （2）生物效应：TNF对多种肿瘤细胞均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异；TNF呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用；TNF能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2R的表达水平，促进T细胞增殖；还能促进B细胞增殖、分化和产生抗体；TNF有中性粒细胞和单核细胞趋化作用，并使之活化和脱颗粒，释放炎症介质；TNF可刺激成骨细胞内的碱性磷酸酶活性，诱导成骨细胞吸收骨质、使软骨细胞进行软骨更新，抑制软骨形成。（3）应用研究：由于TNF的抗肿瘤和免疫调节功能，TNF疗法的研究已被许多国家开展。动物实验和临床经验表明，TNF对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但副作用大，建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。4.造血生长因子：红细胞生成素（EPO）：红细胞生成素（EPO）是一种糖蛋白，分子量约3039KD，主要由肾小管内皮细胞合成，也可由肝细胞和巨噬细胞产生。EP0是一种强效的造血生长因子，活性单一，只作用于骨髓巨核前体细胞，可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落，EP0的产生受机体内血容量和氧分压的调节。 5.细胞因子受体：多数细胞因子受体属于几个大的多基因家族，每个家族的成员具有独特的结构特征，相互之间在进化上可能有一定关系。细胞因子受体家族的划分不是绝对的，有的受体可归于多个家族。细胞因子受体除镶嵌于细胞膜表面的形式外，还有分泌游离的形式，即可溶性细胞因子受体。第二节细胞因子测定方法及应用 一、测定方法检测细胞因子的方法主要有生物学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。（一）生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。生物活性检测法又可分为以下几类：1.细胞增殖法：许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激T细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3 H-TdR掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。2.靶细胞杀伤法：是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。3.细胞因子诱导的产物分析法：某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。4.细胞病变抑制法：病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。（二）免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。此外还可利用酶标或荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体，原位检测因子在细胞内的合成及分布情况。免疫学检测法可直接测定样品中特定细胞因子的含量（用ngml表示），为大规模检测临床病人血清中细胞因子的含量提供了方便。本法仅测定细胞因子的抗原性，与该因子活性不一定相平行，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。（三）分子生物学方法这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术。目前所有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞组织标本）。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。根据其来源可分为cDNA探针、寡核核苷酸探针、基因组基因探针及DNA探针等。其中cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northern blot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：质粒DNA的提取；靶DNA片段的分离；靶DNA片段标记；待测样品mRNA的提取；标记cDNA探针对待检样品的杂交；放射自显影或显色分析。近年来出现的RT-PCR检测特异性mRNA的方法也广泛用于细胞因子研究领域。该法具有灵敏、快速等优点，甚至从l10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，可根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低生物活性检测法（约低l0100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。二、临床应用细胞因子测定可作为特定疾病诊断的辅助指标，用来评估机体的免疫状态、判断治疗及预后，用于临床治疗应用时的监测等。习题79 细胞因子的生物学活性包括A.促进靶细胞的增殖和分化B.增强抗感染和细胞杀伤效应C.促进和抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达D.促进炎症过程，影响细胞代谢E.中和及溶解病毒作用（或换成：直接刺激B细胞产生抗体）答疑编号500734150101正确答案A、B、C、D习题80 既能产生IL-2，又具有IL-2R的细胞是A.B细胞B.T细胞C.NK细胞D.单核-巨噬细胞E.K细胞答疑编号500734150102正确答案B习题81 IL-1的主要生物学活性是A.促进T淋巴细胞活化、增殖和分化B.增强CTL和NK细胞的杀伤活性C.协同IL-4刺激B细胞增殖、分化和Ig产生D.协同CSF促进造血细胞，刺激干细胞产生E.促进B细胞生长分化答疑编号500734150103正确答案A、B、C、D、E习题82 3H-TdR掺入试验测定白介素-2活性，下列哪种说法是正确的A.测得cpm值越高，说明IL-2活性越低B.测得cpm值越高，说明IL-2活性越高C.测得cpm值越低，说明IL-2活性越高D.测得cpm值与IL-2活性无关E.cpm值与IL-2活性呈不规则性变化答疑编号500734150104正确答案B习题83 关于用MTT比色法检测IL-2活性的表述，错误的是A.需要依赖细胞株B.活的增殖细胞具有吸收MTT能力C.颜色深浅反应细胞代谢活性的强弱D.可反应B细胞功能E.反应T细胞功能答疑编号500734150105正确答案D第十六章细胞粘附分子测定及应用（略） 第十七章免疫球蛋白检测及应用本章考点1.免疫球蛋白（Ig）的概述2.Ig测定及临床意义3.M蛋白的检测及意义4.冷球蛋白测定第一节免疫球蛋白的概述 一、概念1.免疫球蛋白（Ig）：是一组具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。Ig由浆细胞产生，存在于血液和体液（包括组织液和外分泌液）中，也可作为抗原受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白。多数Ig具有抗体活性，可以特异性识别和结合抗原，并引发一系列生物学效应。2.抗体：是机体在抗原刺激下，由浆细胞合成分泌产生的具有与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，即具有免疫功能的球蛋白。抗体是生物学功能上的概念，免疫球蛋白是化学结构上的概念。所有的抗体均是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。二、免疫球蛋白的化学结构1.Ig的基本结构：Ig分子由4条肽链借链间二硫键连接组成，即2条相同的重链（H）和2条相同的轻链（L）和几对二硫键连接成一个基本单位。称为单体。IgG、IgE、IgD及多数血清型IgA皆为单体，分泌型IgA为双体，IgM为五聚体。免疫球蛋白分子H链的N端14处氨基酸的种类和顺序随抗体特异性不同而各不相同，称为可变区（VH区）；H链C端其余部分的氨基酸，在种类和顺序上彼此间差别不大，称为稳定区或恒定区（CH区）。L链N端的一半为可变区（VL区），其余一半为恒定区（CL区）。2.功能区：Ig分子的H链与L链各区段可通过链内二硫键折叠成彼此相似球状结构，担负特定免疫学功能，称为功能区。L链有两个功能区，称为VL、CL。IgG、IgA的重链有一个VH和三个CH（CH1、CH2、CH4）功能区。IgM、IgD、IgE的重链有一个VH和四个CH（CH1、CH2、CH3、CH3）功能区。各功能区的功能各异，VH和VL是抗原结合部位；CL、CH是遗传标记所在；CH2有补体结合点；CH3能固定组织细胞；CH3和CH4还参加型变态反应。3.Ig的水解片段：Ig分子可被许多蛋白酶水解，产生不同的片段。免疫学研究中常用的酶是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为三个片段，即两个完全相同的抗原结合片段Fab和一个可结晶片段Fc。用胃蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为一个大分子F（ab）2片段和若干无活性小分子多肽片段pFc。三、免疫球蛋白的血清型1.同种型：同种系间所有正常个体都具有的Ig抗原特异性，称同种型。Ig同种型抗原特异性具有种属特异性。同种型抗原决定簇存在于Ig恒定区。根据Ig重链或轻链恒定区同种型抗原决定簇的不同，可将Ig分为若干类、亚类型和亚型：（1）类和亚类：根据Ig重链恒定区的结构不同和抗原特异性的不同，可将Ig分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。同一类免疫球蛋白分子重链恒定区抗原特异性又有差异又可分成亚类，如IgG可分为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4；IgM可分为IgMl、IgM2；IgA可分为IgAl、IgA2。（2）型和亚型：根据轻链恒定区肽链抗原特异性的不同，各类Ig可分为和两型。2.同种异型：同种不同个体间Ig结构和抗原性的差异称同种异型。主要反映在免疫球蛋白分子上重链和轻链恒定区上一个或数个氨基酸的行不同。与同种型的区别在于，同种异型的特异性只存在于同种的某些个体中，而同种型的特异性则普遍存在同一物种的所有个体。3.独特型：同一个体内，不同B细胞克隆所产生的免疫球蛋白分子V区具有不同的抗原特异性，由此而区分的型别称为独特型。独特型的抗原决定簇可在异种、同种异体以及自体内诱导产生相对应的抗体，称为抗独特型抗体。独特型和抗独特型抗体将整个抗体组成一个网络，称独特型网络。独特性网络在免疫应答的调控中起重要调控作用。四、免疫球蛋白的生物学活性抗体是具有双功能的分子，它既可特异性结合抗原，又可独立诱发或执行一系列生物学效应，由抗体分子不同部位分别执行。1.与抗原结合作用：抗体分子在结合抗原时，其Fab片段的V区与抗原决定簇的立体结构（构象）必须吻合，特别与高变区的氨基酸残基直接有关，且两者所带电荷也应相互对应。所以抗原-抗体的结合具有高度特异性。尽管某些氨基酸残基在肽链的氨基酸顺序上相距很远，但由于肽链沿功能区长轴平行方向往返折叠，使它们能紧密接近，形成一双层排布的凹型或袋状包围抗原的活性部位，双层间存在许多疏水氨基酸侧链。抗体分子与抗原的相互作用靠各种非共价力，如氢键、静电引力和范德华力等，是一种可逆性反应。抗体与抗原结合后抗体Fc段变构产生其他生物效应。天然Ig分子不能起这种作用。但在无抗原作用时，某些物理处理（如加热、凝聚等）也可模拟Ig分子构象的变化而起激活效应机制的作用。2.补体活化作用：补体Clq与游离Ig分子结合非常微弱，而与免疫复合物中的IgG或IgM（经典途径）或凝聚Ig（替代途径）结合则很强。Clq与IgG Fc段的CH2功能区起反应，其结合位点在3个氨基酸侧链上。所有IgG亚类的单独Fc片段对Clq具同样的亲和性；但完整蛋白则主要是IgG1和IgG3才能结合Clq而激活补体的经典途径；IgG2激活补体能力较差；IgG4、IgA不能通过经典途径激活补体。这可能与它们的铰链区结构对Clq结合的影响有关；IgM激活补体能力最强；IgG最少需两个紧密并列的分子才能有效地激活Clq；而IgM单个分子在结合抗原后即可激活补体。3.亲细胞作用：IgG分子能与细胞表面的Fc受体结合。不同类别的免疫球蛋白可与不同的细胞结合产生不同免疫效应。IgG Fc段与单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞表面Fc受体结合产生调理作用；与NK细胞Fc受体结合发挥ADCC效应；与胎盘膜细胞Fc受体结合能使IgG穿过胎盘合胞体滋养层。IgA Fc段与单核细胞或中性粒细胞表面Fc受体结合，也可发挥调理作用。IgE Fc段与嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板等表面受体结合，当再遇相应抗原时，可引起型超敏反应。4.调理作用：（1）通过C3受体进行；（2）通过激活的C3和吞噬细胞的C3受体相结合促进吞噬；（3）经补体旁路非特异激活C3后进行。5.膜传递作用五、免疫球蛋白的特点五类免疫球蛋白虽都有结合抗原的共性，但它们在分子结构、体内分布、血清水平及生物活性等方面也各具特点。1.IgG：IgG为标准的单体分子，含1个或更多的低聚糖基团，电泳速度最慢，是再次免疫应答的主要抗体，具有吞噬调理作用、中和毒素作用、中和病毒作用、介导ADCC、激活补体经典途径，并可透过胎盘传输给胎儿。IgG合成速度快，分解慢，半衰期长，在血中含量最高，约占整个Ig的75%；各亚类所占的比例大约为：IgG1 60%70%，IgG2 15%20%，IgG3 5%l0%，IgG41%7%，各亚类的比例随着年龄及遗传背景而变化，同时各亚类的生物学和免疫学性质也不尽相同。2.IgM：IgM为五聚体，是Ig中分子量最大者。分子结构呈环形，含一个J链，各单体通过链倒数第二位的二硫键与J链互相连接。IgM凝集抗原能力比IgG大得多，激活补体的能力超过IgGl000倍，当有补体存在时，具有吞噬调理作用。血型中天然凝集素和冷凝集素的抗体类型是IgM；不能通过胎盘，新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；在抗原的反复刺激下，可通过Ig基因的类转换而转向IgG合成。当分泌物中IgA缺陷时，IgM也和IgA一样可结合分泌片而替代IgA，IgM也是B细胞上的主要表面膜Ig，作为抗原受体而引发抗体应答。其血中含量约占血清Ig总量6%l0%。半衰期短，出现早，消失快，组织穿透力弱。0.1M2-巯基乙醇能破坏IgM，但不破坏IgG，是分别测定IgM、IgG的简单方法。3.IgA：IgA可分为血清型和分泌型。大部分血清IgA为单体，其他为双聚体或多聚体。占血清中免疫球蛋白总量的10%20%。血清型IgA主要为单体，以无炎症形式清除大量的抗原，这是对维持机体内环境稳定的非常有益的免疫效应。分泌型IgA（SIgA）为双聚体，每一SIgA分子含一个J链和一个分泌片。SIgA性能稳定，在局部浓度大，能抑制病原体和有害抗原粘附在黏膜上，阻挡其进入体内，同时也因其具有调理吞噬和溶解作用，构成了黏膜第一线防御机制；母乳中的分泌型IgA提高了婴儿出生后46个月内的局部免疫屏障，常称为局部抗体。4.IgD：IgD分子结构与IgG非常相似，有明显的铰链区，其蛋白质高度糖基化。IgD性能不稳定，血清中含量很低，占全部免疫球蛋白的0.2%左右，可作为B细胞表面的抗原受体。5.IgE：IgE为单体结构，分子量大于IgG和单体IgA，含糖量较高，链有6个低聚糖侧链。正常人血清中IgE水平在5类Ig中最低，仅为0.10.9mgL。IgE水平与个体遗传性和抗原质量密切相关，因而其血清含量在人群中波动很大。在特应性过敏症和寄生虫感染者血清中IgE水平升高；IgE不能激活补体及穿过胎盘，但它的Fc段能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的受体结合，介导型变态反应的发生，因此又称亲细胞抗体。第二节免疫球蛋白的测定及临床意义 一、IgG、IgA、IgM的测定1.方法：有单向琼脂扩散法、速率散射比浊法等。2.临床意义（1）Ig降低：一种或多种Ig水平减少，分为原发性和继发性。见于各种先天性或获得性免疫缺陷病。继发性常与免疫抑制剂应用、射线、蛋白质丢失、营养不良等有关。也可见于细胞毒药物治疗后。（2）Ig升高：多克隆性增高，见于各种慢性感染、慢性肝病、某些自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等；也见于寄生虫疾病、结节病等。单克隆性增高，又称M蛋白增高，主要见于免疫增殖性疾病，如多发性骨髓瘤、重链病、轻链病，原发性巨球蛋白血症等。二、IgD的测定1.方法：有单向琼脂扩散法、ELISA等。2.临床意义：IgD的生物学功能未全阐明。其增高可见于多发性骨髓瘤等。三、IgE的测定1.方法：目前检测方法有多种，包括ELISA、间接血凝试验、放射免疫法、化学发光免疫分析、免疫荧光测定法等。2.临床意义（1）IgE增高：见于IgE型多发性骨髓瘤、特应性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、寄生虫感染、热带嗜酸粒细胞增多症、SLE、RA及某些霉菌病等。（2）IgE减低：一般无意义。可见于原发性无丙种球蛋白血症、