雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究-硕士论文

厦门大学 硕士学位论文 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 姓名 黄水英 申请学位级别 硕士 专业 海洋化学 指导教师 蔡明刚 20080901 摘要 摘要 虾青素是 种具有高经济价值的类嘏萝卜素 鉴于其强大的抗氧化功能 在 饲料 食晶 傈健品 化妆品及医药等行业均存在广泛应用和广阔酌发展前景 作为新有毫籍的虾青素合成生物体孛积累量最高斡物种 蔫生红球藻己成惫近年 来该领域的研究热点之一 本文首先开展了雨生红球藻混合营养和异养培养方式下的最佳碳源及其浓 度研究 结果表骧 在混合营养和异养培养条件下 醋酸钠均是较丙二酸钠更适 手雨生红球藻生长和虾青素积累的碳源 其最佳初始浓度分别为1 0g L 1 和2 0 g L 其细胞平均生长速率分别为0 2 9 1 和O 1 3 6 扩 胁迫7d 后细胞干重和 虾青素含量分裂隽0 9 8 7 L 0 1 0 l g L 2 0 3 0 4 圭0 7 0 5m g 0 2 和0 7 6 3 t 0 0 5 1g r 1 1 4 9 2 8 t 0 5 1 8m g L 1 混合营养较对照组 光合是养 提高2 5 和2 惩异 养培养则下降 因此结果表明以1 0g L 醋酸钠为碳源的混会营养方式是适合雨 生红球藻培养的最佳营养方式 其次开展最佳营养方式结合半连续培养模式研究发现较一次培养 半连续培 养模式下一定的更新率 2 0 3 0 能有效促进雨生红球藻的生长和虾青素 的积累 其中 更新率组的藻粉产率最高 达1 3 2g U 丽3 0 更新率缰的 虾青素产率最高 达2 2 9 4m g o 但与2 0 蔓薪率维差异不显著 矿O 0 5 此外利用光生物反应器培养藤生红球藻 能使雨生红球藻细胞获得快速生 长 提高生物量 并缩短胁迫周期 但虾青素的产率并不离 本文还开展了C 侥超临赛萃取惑生红球藻中虾鬻素的工艺研究 在戮内尚 属首次 以虾青索提取率为指标 通过考察萃取压力 萃取温度 C 0 2 萃取流速 三因素对该指标的影响 应用了中心组合设计实验与响应面分析方法 建立了最 佳工艺条件药 萃取压力4 4 6M P a 萃取溢度甜 2 c 0 2 流速7 1L 嚣1 萃取 时阗3 5h 在此条件下获褥的虾青素提取率可达1 0 2 8 本研究还针对雨生红球藻来源的虾脊素的稳定性开展研究发现 湿度离子 毒e 可影响色素的稳定性 光照可导致虾青素的降解 不圈光照对虾毒素稳定 性影响作用的大小顺序为避光 室内光 a 胡萝 素 多 胡萝 素 红木素 玉米黄质 黄体素 胆红素 腱绿素 M o r t e n s e n e ta 1 1 9 9 7 虾青素具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力 其对人类身体的健康起着 极其重要的作用 可有效地防止组织 细胞和D N A 被氧化损伤 汪洪涛 2 0 0 6 具体功能如下 1 显著增强肌体免疫力虾青素可增强T 细胞 刺激人体内血细胞产生 免疫球蛋自 J y o n o u c h ie t a l 1 9 9 6 能显著增强肌体的免疫系统功能 增加肌 体对病毒 细菌 寄生生物等的抵抗力 O k a ia n dH i g a s h i O k a i 1 9 9 6 对恢复 老龄动物的体液免疫系统作用明显 N i s h i k a w ae ta 1 1 9 9 7 此终 其在抗原入 侵初期增强特异性体液免疫反应的效果优予B 胡萝卜素等物质 O C o n n e ra n d O B r i e n 2 0 0 0 2 卓越的抗癌 防癌特性虾青素可有效的抑制癌变 对膀胱癌 口腔 癌 结肠癌 乳腺癌 胃癌和肝癌等众多癌症均有显著的抑制效用 且所需剂量 较小 L e ee ta 1 1 9 9 7rG r a d e l e te ta 1 1 9 9 8 L o r e n za n dC y s e w s k i 2 0 0 0 3 优良的抗衰老 防老化能力虾青素强大的抗氧化活性使其成为商效 的光保护剂 通过口服可起到阻止皮肤光老化的作用 且作用效果优于维生素A 褥生红球藻的培养及篡掰青索的提取 稳定性鞫巍用研究 p 胡萝卜素和叶黄素 L o r e n za n dC y s e w s k i 2 0 0 0 此外 虫下青素可以强化肌体 需氧代谢 增强肌肉力量和耐受力 起到抗衰老的作用 魏东和严小君 2 0 0 I 乏霉 卓越魏游治心盔警等疾病功效不趣襄脂翁酸吴有降垂 降盘嚣 致 善血液燕质等功用 露虾青素刘是人体内誉饱和脂肪酸的保护剡 防止其被氧化 麸褥降低心血篱疾病蛉发病率 L o r e n za n dC y s e w s k i 2 0 0 0 此鲤 虾青素麓 有效防止撬嬲膜氧纯秘感光器维稳损嫠 维护视觉系统靛毽康 霹黠 虾青素露 由于受到氧化损伤丽导致的脊髓损伤 帕金森氏综合症等多种中枢神经系统的损 伤具有鼹著疗效 M a r t i ne ta 1 2 0 0 3 1 3 2 着色功麓 虾脊素是一种粉红色的类麓萝b 素 是类胡萝卜素生物合成途径的合成终 点 吴蠢较强酶色素撬积能宓乏吴汪等 1 9 9 7 它进入动物体嚣可以不经黪镰 或生物转化直接贮存在组织中 使鱼 虾 蟹等的皮肤謦日肌肉璺现健康丽鲜艳的 颜色 使家禽的羽亳 皮肤 脚及禽蛋等呈现金黄色或红色 屈健 2 0 0 2 大 多数动物都不能合成类端萝卜素 爨此冀鲜艳体色瓣维持只裁依赖煞潦瓣类麓萝 素兹补充 旱在1 9 8 0 荦 J o h n s o n 等在鲑蛰 鳟趣藉褥建的镯料中添翔可产生虾青素的 袭发夫酵母 使褥它嬲懿体色交霉鲜亮 蔡骥剐等 2 0 0 3 陆开形等 2 够 北极红点鲑饲料中添加虾青索 其肌肉的红色程度与添加虾黉素豹量呈正相关 屈健 2 0 0 2 虾青索是大玛哈鱼和红鳟鱼饲料中的苜选色素 C h o u b e r te t a l 1 9 9 6 B e l le ta l 2 0 0 0 虹鳟薛镳料率添熊1 0 0m g L 心酌虾青素可使箕飘岗中 熬类胡萝 素禽量大幅度升离 C h o u b e r t 戡a l 1 9 9 6 虾青豢麓够增加红惫棘 鬟鱼背部皮肤中类胡箩 素含量 从而影响其背部皮肤的色度 使其接近予野生 鱼的水平 参瓣萝孓素帮番茄红素均无越效采 S t a v r o s 2 0 0 5 虾青素霹有效 地改善葬建鱼 蛭 蟹的体趣 可提鑫其视觉美感及索蝼价值 是业态入士公诀 效果最健的观赏鱼着色剂 A k oa n dT a m a r u 1 9 9 9 饲喂添加合成虾青素饲料 的锦鲤 其体色与来添加组对阮显著增强 喂食富有虾青素的雨生缀球藻的金鱼 瞧髓够获得最佳豹红色色度 鑫毒 G o u v e i a 嫒a l 2 0 0 3 金鱼饲料孛添加嚣9 m g k g 谶1 0 0m g 培 的虾青素 其皮肤和尾鬯中类胡萝卜素的沉积量最高 G o u v e i ae ta l 2 0 0 5 与仅嚷添撼融嘏萝卜素嚣锊料裙魄 喂食添加虾脊素 4 第一章绪论 或虾青素与p 胡萝卜素混合物饲料的脂鲤 H y p h e s s o b r y c o nc a l l i s t u s 体内虾青 素含量较高 W a n g e ta 1 2 0 0 6 有关养殖观赏鱼的着色目前尚未发现有任何一 种产品能像由雨生红球藻提供的天然虾青素那样效果显著而且持久 蔡明刚等 2 0 0 3 1 4 虾青素的应用 超强的抗氧化能力和多种的生物活性 以及艳丽的红色赋予了虾青素广泛的 应用前景和市场潜力 它已广泛应用于水产 家禽养殖业 食品 保健品 化妆 品和医药业 其中 水产养殖业是虾青素最大的市场之一 加拿大的F I A 和美 国的F D A 已批准雨生红球藻藻粉可以作为三文鱼的色素添加剂 虾青素作为水 产饲料添加剂的应用价值在于它能显著提高养殖动物的体色 增强机体免疫能 力 大幅度提高存活率 促进生长 繁殖和发育 饲料中添加一定量的虾青素能 有效提高鱼 虾 蟹等水产养殖生物的营养价值 使养殖对象组织中的维生素A C E 的含量明显增加 类脂含量也呈现显著的增加趋势 增加量可达2 0 以上 C h r i s t i a n s e ne ta 1 1 9 9 5 a L o r e n za n dC y s e w s k i 2 0 0 0 从而大大提高养殖动 物的市场价值 2 虾青素的主要生产方法 2 1 化学合成法 早在8 0 年代 瑞士罗氏 H o f f m a n n L a R o c h e e 公司以 S 3 乙酸基4 氧一p 紫罗酮为前体物质成功的合成了商品名为加丽素红 C a r o h p y UP i n k 的虾 青素 产物多为顺式3 R 3 S 结构 虾青素含量为5 1 0 屈健 2 0 0 2 德 国的B A S F 公司以3 甲级 5 2 6 6 三甲基 3 氧 羟基 1 环己烯基 2 4 戊二烯三 芳基磷酸盐和2 7 一二甲基 2 4 6 三十八烯二醛反应合成9 6 一9 7 的全反式虾青 素 吴彩娟等 2 0 0 3 但化学合成法的工艺复杂 成本高 抗氧化能力和生物 可吸收性和都比天然的低 而且合成过程中可能被其他物质污染 出于安全考虑 化学合成的虾青素在多种食品 饲料 化妆品及医药品上应用受到很大的限制 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 2 2 化学提取法 化学提取法是指利用水产品加工企业的废弃物如虾壳 蟹壳等提取虾青素 据报道其产率可达1 5 3 峙 g 1 废弃物 以美国螯虾加工工业每年约有1 0 0 0 万 吨甲壳类水产品废弃物为例估计的话 可获取1 5 3 0 吨虾青素 然而 水产品废 弃物本身易腐败变质 且生产工艺要求苛刻 生产成本很高 产量较低 产品的 纯度不高 不适合大规模开发 目前只有少数国家应用这种技术来生产虾青素 王 进波 2 0 0 0 2 3 生物技术法 生物技术法生产天然虾青素主要采用微生物发酵和微藻培养两种方法 由于 其产物天然污染少 生物安全性高 日益受到人们的普遍关注 2 3 1 微生物发酵 研究表明野生型红酵母 萧海杰等 1 9 9 9 贾朋辉 2 0 0 4 南极酵母菌 张 先华等 2 0 0 5 刘均玲等 2 0 0 6 黄杆菌 F l a v o b a c t e r i u ms p p 张亮等 1 9 9 9 乳酸分支杆菌 短杆菌1 0 3 等虽然不需要光照且可以发酵培养 成本低 但是菌 体生长较慢且虾青素含量低 仅为0 4 无工业利用前景 2 3 2 藻类培养 很多藻类能够产生虾青素 如极地雪藻 耿予欢等 2 0 0 6 绿球藻 C h l o r o c o c c u ms p M C 1 株系 向文洲等 2 0 0 7 等 雨生红球藻 H a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s 是近年来被研究最多也是应用最广泛的一种 其虾青素的含量可高达 细胞干重的3 0 被看作是天然虾青素的 浓缩品 蔡明刚和王杉霖 2 0 0 3 其虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高 且所含虾青素及其酯类的配比与 水产养殖动物自身配比极为相似 这是通过化学合成和利用酵母菌等提取的虾青 素所不具各的优势 L o r e n za n dC y s e w s k i 2 0 0 0 O m s ae ta 1 2 0 0 1 因此 雨 生红球藻被公认为是自然界中虾青素的最佳来源之一 6 第一乖特论 陌生红球藻 肌聊埘 6 p l u v i a l i s 是一种单细胞淡水绿藻 隶幅绿藻门 C h o m p h a t a 绿藻纲 C h l o r o p h y c c a e 团藻目 V o l v o c a l e s 红球藻科 H a 眦a t o c o c c a c e 红球藻届 H a c m a t o c o c c u s 其生活史呈现多样性 主要 具有营养细胞和厚壁孢子两种形态 在弱光 氮磷丰富的环境中以游动的绿色营 养细胞形态存在 在该过程中雨生红球藻生长旺盛 细胞内虾青素一般含量较低 T a ne t a l 1 9 9 5 而在不利生存的条件 高光照 高温 高盐或营养盐饥饿 下 则失去鞭毛 以不动的厚壁孢子形态存在 并积累大量的虾青素 喜撩寡巯馕亓 等胁i 自条忭下J r 1 L J 目疆丑 落 暑 j 一 胁迫陆陧 一 圈1 3 雨生红球藻的两阶段培养示意圈 F i g 1 3S c h e m a t i c d i a g r a mo f t w o s n g ec u l t u r e s f o r l l a e m a f o c o c c u s p l u v i a l i s 4 培养方式及环境因子对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响 4 1 培养方式 4 1 1 蕾莽方式 根据所提供碳源形式的不同 雨生红球藻的营养方式可分为光台自养 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和成用研究 p h o t o a u t o t r o p h i c 异养 h e t e r o t r o p h i c 和混合营养 m i x t r o p h i c 三种 光合 自养是指微藻在一定光照条件下利用无机碳 如H C 0 3 一 C 0 2 作为碳源的营养 方式 异养一般是指微藻在无光条件下利用有机碳进李亍营养的方式 混合营养是 指微藻在 定的光照条件下以醋酸等有机碳作为碳源的营养方式 同时进行光合 作用自养和利用有机物化能自养 雨生红球藻能在暗环境下剩用有机碳源异养生长 也能在光照条件下利用有 机碳源兼养生长 其代谢机制与其他微藻不同 光合作用和氧化代谢作用是共同 起作用的 且两种代谢机制是独立存在的 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 2 研究表明 合适的碳源及其浓度对异养和混养条件下的盔下青素积累十分重要 K o b a y a s h ie t a 1 1 9 9 1 1 9 9 3 殷明焱等 1 9 9 8 T r i p a t h ie ta 1 2 0 0 2 充足的碳能明显促进 虾青素的积累 T r i p a t h ie ta 1 2 0 0 2 但若加入过量的碳将严重抑制红球藻的生 长 O r o s ae ta 1 2 0 0 1 目前关于碳源的选择及其浓度的研究结果差异较大 一 部分学者认为与其他碳源 丙二酸钠 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 水杨酸等 相比 醋酸钠为最适的碳源 且其浓度不宜过大 为1g L 一1 6 4g L 一 G o n ge ta 1 1 9 9 8 D o m i n g u e z B o c a n e g r ae ta 1 2 0 0 4 庄惠如等 2 0 0 0 相反 有人认为丙 二酸盐作为碳源的效果优于醋酸盐 其虾青素含量是空囱组的1 4 倍 且高浓度 下对红球藻的抑制作用小于醋酸盐 O r o s ae ta 1 2 0 0 5 也有人研究表明 施用 水杨酸能够加快虾青素的积累 虾青素的产量较对照组提高了近7 5 8 达1 6 8 6 m g 离政权等 2 0 0 7 因此不同营养方式下的碳源选择及其浓度仍有待于 进一步研究 混合营养是提高光诱导微藻产生色素的产量的有效方法 mc ta 1 2 0 0 5 在混合营养过翟中 其细胞生长速度 存滔率 虾青素产量均明显高于光合囱养 和异养培养 K o b a y a s h ie ta 1 19 9 3 O r o s ae ta 1 2 0 01 D o m i n g u e z B o c a n e g r ac t a 1 2 0 0 4 高政权等 2 0 0 7 庄惠如等 2 0 0 0 K a n ge ta 1 2 0 0 5 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 7 以醋酸钠为碳源 培养8d 后 与光养型 O 斟童1 和5 8 I L 0 0 9m g g 一 相比 混养型的细胞平均生长速率和虾青素含量分别为O 7 2d 1 和5 9 0 士0 1 0m g g 一 异养型则分别为O 5 3d 和5 0 0 0 0 8m g g 庄惠如等 2 0 0 0 有研究发 现在混养条件下 l 或2 的醋酸钠帮2 丙二酸钠为碳源均能显著提高虾青 素的积累 分别是对照组 光合自养 的3 倍和5 倍 O r o s a e t a l 2 0 0 1 异养 3 第一章绪论 条件下 盐胁迫的雨生红球藻细胞内虾青素含量仅为对照组 光合自养 的四分 之一 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 7 此外 雨生红球藻利用重碳酸盐或C 0 2 进行光 合自养 虾青素的含量 7 7 2m g L 1 是以醋酸钠为碳源异养培养条件下的4 4 倍 K a n g e ta 1 2 0 0 5 由此可见 混合营养的效率优于光合自养 光合自养的 效率优于异养 异养条件下的效果不如光合自养和混合营养 主要是因为有机碳源的加入容 易带来细菌污染 导致藻体生长缓慢 但是异养具有后两者不具备的优点 即不 需要光照 大大降低了生产成本 从经济角度而言有助于商业化生产 已有研究 表明在一个3 7L 的发酵罐里进行雨生红球藻的异养培养 细胞密度可高达6 5 g L 一 可见异养培养雨生红球藻也能获得高生物量 C h e r te ta 1 1 9 9 7 而且 目前已有许多微藻如小球藻 螺旋藻实现了异养发酵生产 既获得高生物量 又 极大减少生产投入 并业已实现规模化生产 C h e ne ta 1 2 0 0 6 创造出可观的 经济效益 因此借鉴其他微藻的异养培养 研究开发利用异养发酵培养雨生红球 藻来生产虾青素是十分必要的 4 1 2 培养模式 根据雨生红球藻的不同存在形式 一般将虾青素的生产分成微藻培育和虾青 素积累两阶段进行 第一阶段实现雨生红球藻营养细胞的高密度生长 此阶段微 藻中虾青素含量甚少 第二阶段中 往往多通过设置高光照 高温或高盐等人为 胁迫手段 促使营养细胞在恶劣的生存环境下转变为厚壁孢子 以达到积累虾青 素的目的 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 3 F a ne ta 1 1 9 9 4 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 S a r a d a 2 0 0 2 雨生红球藻的培养模式主要有如下两种 一次培养 或有限培养 b a t c h c u l t u r e s 指少量藻液进行接种 培养一段时 间 藻类生长繁殖达到较高的密度 即进行采收或进一步扩大培养 将收获藻液 置于高光照 高温 高盐和营养盐饥饿等胁迫条件下 促使营养细胞在恶劣的生 存环境下转变为厚壁孢子 以达到积累虾青素的目的 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b S a r a d a e ta 1 2 0 0 2 一次培养模式较为传统 目前国内外的雨生红球藻研究一般均建 立在此培养模式上 该模式耗时长 产率低 连续性差 而且雨生红球藻在胁迫 过程中大量死亡 不利于大规模培养 半连续式培养 s e m i c o n t i n u o u sc u l t u r e s 是指在一次培养的基础上 当培养 9 雨生红球藻的培养及熊虾青素的提取 稳定性和成用研究 藻类细胞达到相当浓度后 每天收获 部分藻液 并补充等量的新鲜培养液 继 续培养 收获的藻液转入胁遣 积累虾青素 F 森b r e g a s 等 2 0 0 1 默雨生红球藻 C e 船3 7 缮 于O H M 培养基孛进行过相关研究 并推辑以半连续模式应用于 雨生红球藻的培养具有一定可行性 如若采用半连续式的红球藻培养方法 使红 球藻绿色营养细胞在稳定的生理特性条件下 以恒定生长速率连续生产 可获得 高产红球藻 剿可推动雨生红球藻的工曼讫生产 4 1 3 毙生物反蔽器韵嵩密度培养法 嚣蓠使焉的先生物反应器主要分秀蓊大类 鄹开放式毙生物反应器昶封闼式 光生物反应器 开放式光生物反应器结构简单 投资成本低 技术要求较低 但 却存在培养条件难以控制 易受环境污染等缺点 较不适合雨生红球藻大规模培 养 封闭式先生物反应器麓较好酶控制培养环境 僳护徽藻不受周围环境的污染 可以实现赢细胞密度培养 魏东和臧晓南 2 0 0 1 K a e w p i n t o n ge ta 1 2 0 0 6 近年来 光生物反应器发展迅猛 国外学者利用光生物反应器进行雨生红球藻的 培养研究已有不少报道 V e g a E s t r a d a e ta l 2 0 0 5 L e ee ta 1 2 0 0 6 L o p e z e t a l 2 0 0 6 P o w t o n g s o o k e ta 1 2 0 0 6 S u be ta l 2 0 0 6 K a e w p i n t o n ge ta l 2 0 0 6 R a n j b a re ta 1 2 0 0 7 且已大规模利用光生物反应器进行微藻商业化生 产 舞美国赞C y a n o t e c h 和A q u a s e a r c h 等凡家大公雹己能够利爝光生物反应器培 养红球藻实现天然虾青素豹规模化生产 国内光生物反应器的研究楣对比较薄 弱 各种硬件相对不足 关予利用光生物反应器进行雨生红球藻的培养仅有若干 稿关报道 应巧兰和时勇 2 0 0 3 剃伟等 2 0 0 6 吴霞等 2 0 0 6 我翻有良 好的气候条件 日照时趣裾对较长 和辽鲻的土地 菪能因地铡宣充分裂用太鬻 光 进行传统的室外大池培养 将熙符合我国国情 因此研究利用光生物反应器 进行二级培养 藻种培养兔 级培养 从箍为室外大池培养提供大量藻种 逐 级放大 最终实现秀生红球藻翡趣模化齑韭化生产 4 2 环境因子对礴生缀球藻合成虾青素韵影晌 在雨生红球藻的两个除段培养中 英所需的营养及环境条件不同 第一章绪论 4 2 1 光照 一般认为 2k l x 以下的弱光有利于红球藻营养细胞的培养 蔡明刚等 2 0 0 3 其中最佳光强范围为1 1l d x 1 3k l x L ue t a l 1 9 9 4 H a r k c ra n d Y o u n g 1 9 9 5 就光的性质而言 红光可促进雨生红球藻的生长 T o m o h i s ac ta 1 2 0 0 4 吴霞等 2 0 0 6 光照是诱导虾青素大量积累的重要因子 邱保胜等 2 0 0 0 高光强有利于 虾青素积累而不利于生长 殷明炎等 1 9 9 8 但光照过强会致使红球藻大量死 亡 B o u s s i b ae ta 1 1 9 9 2 H a r k e rc ta 1 1 9 9 6 b 不同学者研究结果稍有差异 研究表明 虾青素积累的最适光强范围为3 4 4k l x 3 6 6k l x H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b 雨生红球藻置于1 0k L x 1 2k L x 光强下 营养细胞迅速由绿色变为红色 大量积 累虾青素 庄惠如等 2 0 0 1 光强为1 7 0g m o l I n 2 S 一 虾青素的含量为2 0P g c e l l s d H ee ta 1 2 0 0 7 在光的性质方面 蓝光较红光更有利于红球藻合成虾青素 T o m o h i s ae ta 1 2 0 0 4 吴霞等 2 0 0 6 目前出现如闪光等新型的胁迫方式 如利用发光二极管发射出的闪光能显著促进雨生红球藻中虾青素的积累 含量高 达7 0 肛g m L 一 A b d o l m a j i d e ta 1 2 0 0 5 T o m o h i s ae ta 1 2 0 0 4 4 2 2 温度 温度对雨生红球藻生长的影响 不同研究结果差异较大 各研究表明 最适 温度为1 4 1 5 H a r k e re ta 1 1 9 9 5 2 5 2 8 L uc ta 1 1 9 9 4 2 0 左右 殷明炎等 1 9 9 8 2 5 下 T r i p a t h ic ta 1 2 0 0 2 1 5 2 0 蒋霞敏 等 2 0 0 5 不同藻种的最适生长温度各异 H p l u v i a l i s 2 6 H p l u v i a l i s 3 0 H p l u v i a l i s 3 4 和H p l u v i a l i s W Z 分别在2 0 2 5 2 0 l5 时生长繁殖最 快 张宝玉等 2 0 0 3 由此可见 雨生红球藻适宜于低温环境下生长 温度范 围为1 4 2 8 之间 低温有利于雨生红球藻的生长 高温则有利于红球藻积累虾青素 B o r o w i t z k ae ta 1 1 9 9 1 在3 0 的培养条件下红球藻的虾青素积累量是2 0 时的3 倍 T j a h j o n oc ta 1 1 9 9 4 但也有研究认为3 5 的培养温度可促进各种 营养条件下虾青素的累积 T r i p a t h ie ta 1 2 0 0 2 也有学者研究得出2 5 3 0 的 温度有利于虾青素累的积量 蒋霞敏等 2 0 0 5 总之 提高温度有利于雨生红 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 球藻中虾青素的积累 4 2 3p H 雨生红球藻是淡水藻类 对p H 的缓冲能力较弱 殷明焱等 1 9 9 8 大量 研究表明 红球藻适宜于中性或稍碱性条件下生长 邱保胜和刘其芳 1 9 9 9 H a t ae ta l 2 0 0 1 多数学者认为蛳值在7 乳8 0 之间适合雨生红球藻生长 陈 兴才等 2 0 0 6 程伟等 2 0 0 7 S a r a d ae ta 1 2 0 0 2 品系为H p l u v i a l i s W Z 的最 适p H 为弱酸性和中性 属较特殊的 张宝玉等 2 0 0 3 实验证舞 虾青素产量的变化与培养基孛p H 范围有很大关系 H a t ae ta 1 2 0 0 1 p H 为7 0 时 虾青素的产量显著增加 S a r a d a e ta 1 2 0 0 2 4 2 4 盐度 盐度的适当增加会抑制微藻的生长 但可促进厚壁孢子的形成及虾青素的积 累 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 7 a 黄水英等 2 0 0 8 添加 定 量的 0 5 5 阮 6 3 的N a C l 有剩于蒸生红球藻合成虾青素 僵盐度不宣太高 当N a C l 浓度超过1 0 会使雨生红球藻大量死亡 S a r a d ae ta 1 2 0 0 2 4 2 5 维生素 维生素不是雨生红球藻生长的必需营养物质 但添加适量的维生素B 可以 改善其生长 金传荫等 1 9 9 7 邱保胜和刘其芳 2 0 0 0 添加适量的维生素B l B 1 2 霹促进红球藻水生7 4 8 株 H a e m a t o c o c c u ss p H B 7 4 8 的生长 金传荫等 1 9 9 7 维生素B 1 2 能有效促进雨生红球藻7 1 2 株的生长速率 但对其产量却几 乎没有影响 张宝玉等 2 0 0 3 添加维生素B l B 1 2 可有效提高藻粉产量和虾 青素产量 张英等 2 0 0 4 4 2 6 营养元素 1 氮盐 氮是雨生红球藻生长的必需元素 最适氮源为硝酸盐 适宜氮浓度范围在 2 5 1 0m m o l L 1 之闻 B o r o w i t z k ae ta l 1 9 9 1 H a r k e ra n dY o u n g 1 9 9 5 低氮 1 2 第一章绪论 或氮缺乏可促进雨生红球藻大量积累虾青素 多数学者认为可通过调节培养液中 硝酸盐的浓度来控制红球藻对虾青素积累 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b F f i b r e g a se ta 1 1 9 9 8 G o n g 和C h e n 1 9 9 8 认为低浓度的氮 O 0 3g U 1 K N 0 3 有利于虾青素 的积累 培养液中的氮完全消耗 即缺氮 时才有虾青素的明显积累 庄惠如等 2 0 0 0 F f i b r e g a se ta 1 2 0 0 1 O r o s ae ta 1 2 0 0 5 然而也有研究结果表明氮的存 在是虾青素积累的必要条件 B o u s s i b ae ta 1 1 9 9 2 2 碳源 碳是微藻生长重要元素 它提供细胞中有机物如蛋白质 碳水化合物 脂肪 酸等的碳骨架 补充碳源的方法主要有充C 0 2 添加N a H C 0 3 以及添加乙酸钠 殷 明焱等 1 9 9 8 培养基中加入一定浓度的醋酸盐较适合雨生红球藻的生长 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 1 F a ne ta 1 1 9 9 4 乙酸钠较葡萄糖等其它碳源更能维 持雨生红球藻进行混合营养生长和异养生长 两种营养类型下 对乙酸钠的浓度 要求分别为0 5g L 1 0g L 1 和1 0g L 一 1 5g L 以 庄惠如等 2 0 0 0 a 充足的碳对虾青素的积累也很重要 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 1 1 9 9 3 殷明焱 等 1 9 9 8 T r i p a t h ie ta 1 2 0 0 2 但若加入过量的碳将严重抑制红球藻的生长 O r o s ae ta 1 2 0 0 1 a 醋酸钠作为碳源的最适浓度为1 6 4g L G o n ga n dC h e n 1 9 9 8 a 醋酸钠浓度为1 Og L 1 时 虾青素含量可提高到9 8m g g d D o m i n g u e z B o c a n e g r ae ta 1 2 0 0 4 丙二酸盐作为碳源的效果优于醋酸盐 其 虾青素含量是空白组的1 4 倍 且高浓度下对红球藻的抑制作用小于醋酸盐 O r o s a e ta 1 2 0 0 5 但也有学者研究表明 乙酸钠的补充与氮缺乏对虾青素的 积累具有协同作用 胡章立等 2 0 0 2 3 磷盐 研究表明 中等浓度的磷 0 1g L dK 2 H P 0 4 即可满足其生长需要 B o r o w i t z k ae ta 1 1 9 9 1 且磷酸盐的加入可以提高红球藻培养液中的缓冲性 能 扩大其p H 适应范围 很多研究表明 磷缺乏同样可以促进虾青素的积累 但效果不如氮缺乏显著 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b B o u s s i b ae ta 1 1 9 9 9 H ee ta 1 2 0 0 7 也有研究报道 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 较高的磷浓度有利于虾青素的积累 B o r o w i t z k ae ta 1 1 9 9 1 4 硫酸盐 硫酸盐对虾青素的积累影响的研究甚少 已有研究表明 缺硫对于虾青素的 积累极为显著 与缺氮效果相当 H e e ta 1 2 0 0 7 5 F e 2 铁的价态 形态等对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响明显 研究表明 不同形态的铁对雨生红球藻生长和虾青素的积累均具有促进作用 促进效果依次 是 柠檬酸铁 E D T A 络合铁 胶体态水合氧化铁 不同价态的铁对雨生红球藻生 长影响各异 F e 3 较F e 更有利于雨生红球藻在营养生长阶段的生长 且较F e 2 组提高1 6 而F e 2 更能够提高雨生红球藻细胞积累虾青素的能力 其虾青素 含量较F e 3 组高l O 齐安翔 2 0 0 6 这与已有研究结果相似 高浓度的F e 可促进红球藻对虾青素的积累 但效果不如缺氮 缺磷显著 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 1 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b 此外 F e 2 与某些盐共同作用对虾青素的积累产生 不同的影响 如F e 2 与醋酸盐一同加入更有利于虾青素的合成 但瓣存在时这 静作用受到抑制 K o b a y a s h ie ta l 1 9 9 3 4 2 7 活性氧 溶解氧和多种活性氧分子 1 0 2 H 2 0 2 p e r o x y lr a d i c a l 和s u p e r o x i d ea n i o n r a d i c a l 的存在都可以有效地诱导细胞内虾青素的合成 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 b K o b a y a s h i e ta 1 1 9 9 3 T j a h j o n oe ta 1 1 9 9 4 H a g e ne ta 1 2 0 0 1 已有研究发 现在氮限制的连续恒化培养中 溶氧分匿的升高馒红球藻不动细胞数匮增 J l l L e e e ta 1 2 0 0 6 邱保胜和刘其芳 2 0 0 0 适当浓度的活性氧诱生剂可增加虾青素 含量 但同时又会抑制雨生红球藻的生长 王劲和段舜山 2 0 0 6 碡 第一睾绪论 5 雨生红球藻来源的虾青素的提取 5 重雨生红球藻细胞璧的破碎方式 细胞破碎方式对色素的提取效率来说是非常重要的 在大量的雨生红球藻研 究中 细胞破碎方式有组织匀浆器破壁 H a r k e re ta 1 1 9 9 6 a 超声破壁 欧阳 琴等 2 0 0 5 周湘池等 2 0 0 6 陈兴才等 2 衡7 壬灵昭等 2 7 高压均质 欧阳琴等 2 0 0 5 陈兴才等 2 0 0 7 反复冻融 陈兴才等 2 0 0 7 研磨破碎 J C h o u b c r ta n dH e i n r i c h 1 9 9 3 H a g e nc ta 1 1 9 9 3 K o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 3 王 灵昭 2 0 0 7 酸碱加热法 X y l a n d e ra n dB r a u n e 1 9 9 4 T r i p a t h ie ta 1 1 9 9 9 R i s ee ta 1 1 9 9 4 B a re ta 1 1 9 9 5 S a r a d ae ta 1 2 0 0 6 或酶解破壁 G r u n ge ta 1 1 9 9 2 M e n d e se ta 1 2 0 0 1 等 利用研钵研磨的细胞破碎方法简便 并能有效 的从焉生红球藻中提取虾青素 对于藻细胞的虾青素提取来说 该细胞破碎方法 毙较适宜 Y u a na n dC h c n 2 0 0 0 王灵昭等 2 0 0 7 5 2 雨生红球藻来源的虾青素的提取 5 2 1 溶剂提取法 S o l v e n tE x t r a c t i o n 虾青素属于萜类化合物 极性不强 具有疏水亲脂性 在室溢下易溶于二氯 擎烷 3 0g L d 氯仿 1 eg L 1 二甲亚砜 O 5g L 砖 和丙酮 O 2g L t 等 有机溶剂 J o h n s o ne l a 1 1 9 9 1 虾青索在有机溶剂中的溶解度越大 越利于从 藻细胞中提取虾青素 因此通常采用溶剂提取法 S o l v e n tE x t r a c t i o n 即选用合 适的溶剂使虾青索尽可能多的溶出 文献中常采用单一有机溶剂如丙酮 二氯甲 烷 氯仿 乙酸乙酯 乙醇 石油醚 二硫化碳等或为上述溶剂不同比例的混合 溶剂进行提取 庄惠如等 2 0 0 1 b 欧阳琴等 2 0 0 3 赵立艳等 2 0 0 6 O r o s a re t a 1 2 0 0 5 S a r a d ae ta 1 2 0 0 6 至灵昭等 2 0 0 7 但是有些有桃溶剂虽是虾青 素良好的溶剂 却很难用离心的方法将溶剂与破碎藻细胞完全分离 部分细胞残 骸悬浮于有机溶剂中 对后续的生物利用安全性造成隐患 l S 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 5 2 2 超临界萃取法 S u p e r c r i t i c a lF l u i dE x t r a c t i o n S F E 超蝮界流体是指在临界温度和临界压力下的物质状态 它兼有了气 液体双 重特性 其扩散系数与气体接近 具有较快的传质速率 其密度与液体状态接近 溶解能力较大 从而成为理想的萃取溶剂 超临界流体萃取是刹用超临界流体特 有的溶解能力丽发展起来的一种化工分离技术 2 0 世纪7 0 年代以来 德国 法国 美国等西方发达国家首先将超临界流体 萃取理论用于工业生产中 取得了显著的经济和社会效益 唐仕荣 2 0 0 7 超 临界流体具有诸多技术特点 1 具有高度选择性 可分离高沸点混合物 操作 温度低 适于份力量热不稳定的物质 2 可同时完成蒸馏和萃取过程 可分离 难分离的有机混合物 特别是对同系物的分馏更其特色 3 其萃取能力随流体 密度增加瑟提高 当密度保持不变时 在一定范圈内随摹取时阆延长弱增加 4 可循环利用 耗能较低 无残留 低成本 张镜澄 2 0 0 0 陈虹等 1 9 9 9 超 临界流体萃取技术凭借其独特的优势得到越来越广泛的应用和重视 在食品工业 中主要是脱除嘲唼豆和茶叶中的咖啡因 啤酒花有效成分的萃取 天然香料的萃 取 天然色素的萃取等方面 金竹萍等 2 0 0 7 超临界萃取由于其工艺简单 操作低温 无溶剂残留等特点而成为天然产物的新型工艺之一 廖传华等 2 0 0 7 C 0 2 无毒 无臭 无味 不燃烧 化学性质稳定 不易与溶质反应 监赛点 低 T 3 1 2 6 P 7 2M P a 易达到 纯度高 价廉 易获得 易与溶剂分离 使用安全无污染 当前绝大部分超临界流体萃取都是采用C 0 2 作为溶剂 大量 研究表明C 0 2 超临界萃取已广泛应用于微藻天然产物的提取 M e n d e se ta 1 1 9 9 4 如利用C 0 2 S F E 提取产烃葡萄藻 B o t r y o c o c c u sb r a u n i i 中的碳水化合 物 中肋骨条藻 S k e l e t o n e m ac o s t a t u m 中的脂质化合物 P o l a ke ta 1 1 9 8 9 小球藻中的类胡萝 素和脂旗 M e n d e sa n dF e m a n d e s 1 9 9 5 目前国内外利用C 0 2 超临界萃取雨生红球藻中虾青素的研究不多 研究结 果相对一致 均认为高压 高温 低C 0 2 流速有利于虾青素的提取 M a c h m u d a h e ta 1 2 0 0 6 N o b r ee ta 1 2 0 0 6 国内在利用C 侥超临界萃取雨生红球藻中虾 青素尚未见相关报道 且国外的相关研究基本停留在单因子研究 没有综合考虑 各因素问的相互影响 忽略了因子间的交互作用 因此有待予进一步研究 1 6 第一章绪论 5 2 3 其它提取方法 其他提取方法如微波提取法 酶法提取法 王灵昭等 2 0 0 7 研究利用微波 提取雨生红球藻中的虾青素 当萃取溶剂为乙酸乙酯 乙醇 1 2 v v 萃取时 间为4 5r a i n 萃取功率为5 4 0W 液料比为2 2 0 1 时 虾青素的提取率可达1 0 2 0 N a g a o 等 2 0 0 3 利用C a n d i a d a r u g o s a 酶和P s e n d o m o n a s a e r u g i n o s a 酶水解虾 青素酯转化为游离虾青素 生物安全性高 5 3 虾青素的分离纯化及分析方法 5 3 1 薄层层析法 T h i nL a y e rC h r o m a t o g r a p h y 薄层层析是一种微量而快速的层析方法 其原理是把吸附剂如氧化铝或硅藻 土涂布于薄板上 玻璃或金属等 形成薄层 把要分析的样品溶液滴加到薄层的 一端 然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开 通常用硅胶作为一种固相支持物 与水有较强的亲和力而与有机溶剂的亲和力较弱 层析时吸着在硅胶上的水是固 定相 而展开溶剂是流动相 当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中分配系 数不同时 即能被分离开 通常用比移值 R f 来表征组分移动的特性 采用2 5 丙酮 7 5 正己烷作为展开剂进行薄层层析来分离雨生红球藻中的 类胡萝卜素 得到p 胡萝卜素 海胆酮 虾青素酯 6 条带 角黄素 虾青素 和叶黄素的色素带 其I 玎值分别是0 9 9 0 8 7 0 5 5 0 8 5 0 4 4 0 3 3 和O 2 5 将这些色素带分别剪下后用溶剂洗脱 洗脱后得到纯样品 用氮气吹干后得到纯 品 T o d d e t a le ta 1 2 0 0 0 5 3 2 柱层析法 C o l u m nC h r o m a t o g r a p h y 该法原理同薄层层析 只是将填料制成层析柱 通常使用硅胶目数为 1 0 0 2 0 0 目或氧化铝作为填料 已有研究结果表明使用长度为2 2 5 c m 直径3 0 r n m 的硅胶填充柱纯化雨生红球藻中的虾青素 经流动相将色素过柱分离并洗脱 下来 用H P L C 结合折光示差检测虾青素的纯度达9 8 以上 陈兴才等 2 0 0 5 1 7 雨生红球藻的培养及其虾青素的提取 稳定性和应用研究 5 3 3 高效液相色谱法 H i g h P e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y H P L C 目前最常用的色素分离分析纯化方法是高效液相色谱法 舯L C 其仪器系 统由储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器 数据采集与处理系统等部分组成 其工作原理是基子组分在固定相 柱填料 和流动相 淋洗液 中分配系数的微 小差异 在两相中作相对运动 经过反复多次的吸附一解吸的分配过程 样品中 的各组分将形成不同的迁移速度的谱带而实现分离的新型高效分离技术 目前已 建立雨生红球藻中虾青素的反相H P L C R e v e r s e d P h a s eH P L C R P H P L C 分离 分析方法 采用二极管阵列检测器 D A D 在4 7 6n n l 处进行检测 虾青素在1 5 r a i n 内得到了较好的分离 雨生红球藻中虾青素的总含量为9 7 9 2 4 7 0m g L 以 齐安翔等 2 0 0 5 随着人们大规模分离生物活性化合物的需要 制备型H P L C 应运箍生 其与 分析型H P L C 差别在于分离目的不同 在分析型中 需要的是反映样品组成的信 息 不需要收集达到特定纯度的馏分 洗提液通常是作为废液来考虑的 僵在制 备型H P L C 中 为了节省投资和操作费用 必须以最少的时闻生产最大量的产品 前者要求样品量越少越好 后者为了提高制备量 柱必须 超载 按照分离一次 进样量的多少 制备型H P L C 分3 种规模 即半制备级H P L C 1 0 5 0m g 克 级HP L C O I Ig 和工业级H P L C 2 0g f 1 魏莉等 2 0 0 5 Y u a n 和C h