lass2与atp6l相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究-生理学硕士论文

分类号 U D C R 2 5 6 1 2 密级 公珏 编号 Q 2 璺9 S Q 璺 墨Q 墨一 江荨大擎 论文题目 专业名称 作者姓名 指导老师 答辩日期 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文 的规定 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权江苏大 学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据 库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文 保密口 在年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密囹 L 学位论文作者签名 三长弓 指导教师签名 己h 少年5 月t 1 日 力 多年 月 日 独创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的 指导下 独立进行研究工作所取得的成果 除文中已注明引 用的内容以外 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的作品成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体 均己在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 雪乒歹 日期 力f 年石月 日 分类号 U D C R 2 5 6 1 2 编号 硕士学位论文 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 L A S S 2i n t e r a c t sw i t hA T P 6 Lt oi n d u c ea p o p t o s i so f h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a 作者姓名 指导教师 申请学位 学科专业 张严 金洁副教授 硕士 生理学 论文答辩日期 2 0 1 2 年6 月6 日 学位授予单位 江苏大学 学位授予日期 2 0 1 2 年6 月 答辩委员会主席 钱晖教授 江苏大学硕士学位论文 摘要 研究目的 研究L A S S 2 h o m os a p i e n sl o n g e v i t ya s s u r a n c eh o m o l o g u e2o f v e a s tL A G l 与质子泵的c 亚基A T P 6 L 1 6k D ap r o t e o l i p i ds u b u n i to f v a c u o l a r 一 A T P a s e 的相互作用 过表达L A S S 2 对肝癌细胞内 外 一浓度的影响 以及对细胞凋亡的影响及对凋亡相关的信号转导通 路的影响 研究方法 1 用真核载体p B i F C V C 15 5 一L A S S 2 和p B i F C V NI5 5 一A T P 6 L 共同转染S M M C 7 7 2 1 细胞 通过双分子荧光互补分析技术 在荧光 显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达 确定L A S S 2 与A T P 6 L 在细胞内 相互作用以及形成异源二聚体的亚细胞定位 2 用p H 荧光探针B C E C F A M 和B C E C F 检测细胞内 外 H 浓度 3 采用细菌内同源重组法构建含L A S S 2 基因全长的重组腺病 毒载体 并将其转染至S M M C 7 7 21 细胞 荧光显微镜检i 贝 重组腺病 毒对肝癌细胞的感染效率 W e s t e nb l o t 检测感染后目的蛋白的表达 4 通过M T T 实验和A n n e x i nV P I 双标法检测L A S S 2 过表达 后对S M M C 7 7 2 1 细胞生长和凋亡的影响 5 通过W e s t e r nb l o t 方法检测S M M C 7 7 21 细胞过表达L A S S 2 后 C a s p a s e 9 C a s p a s e 3 的激活 B c l 2 B a x p E R K 的表达水平 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 变化 研究结果 1 双分子荧光互补分析实验证实L A S S 2 与A T P 6 L 在细胞内 特异性结合 并且它们形成的蛋白异源二聚体主要分布在细胞质中 2 成功构建了重组腺病毒载体A d L A S S 2 并将其感染 S M M C 7 7 2 1 细胞 荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白G F P 的表达 感 染效率达7 0 以上 W e s t e mb l o t 结果表明 L A S S 2 能在细胞中持续 稳定的表达 3 过表达L A S S 2 的S M M C 7 7 2 1 细胞内一浓度升高 细胞 外一浓度降低 4 M T T 和流式结果表明S M M C 一7 7 2 1 细胞过表达L A S S 2 后 其生长能力受到了显著的抑制 凋亡率增加 5 W e s t e mb l o t 结果表明S M M C 7 7 2 1 细胞过表达L A S S 2 后 活性的c l e a v e d C a s p a s e 9 和C l e a v e d C a s p a s e 3 含量升高 B a x 的蛋 白表达水平升高 B c l 2 水平降低 p E R K 水平降低 结论 L A S S 2 可能通过与A T P 6 L 结合抑制V A T P a s e 的外排I i 能 力 抑制E R K l 2 的激活 下调B c l 一2 上调B a x 进而激活线粒体凋 亡通路 进一步活化C a s p a s e 9 C a s p a s e 3 促进肝癌细胞的凋亡 关键词 肝癌 人源长寿保障基因一2 质子泵的C 亚基 质子泵 凋 亡 腺病毒 I I 江苏大学硕士学位论文 O b j e c t i v e A B S T R A C T T os t u d yL A S S 2 h o m os a p i e n sl o n g e v i t ya s s u r a n c eh o m o l o g u e2o f y e a s tL A G1 i n t e r a c tw i t ht h e16 一k D as u b u n i t Co fv a c u o l a rp r o t o np u m p A T P 6 L O v e r e x p r e s s i o nL A S S 2a f f e c ti n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rH c o n c e n t r a t i o n L A S S 2a f f e c tt h el i v e rc a n c e rc e l l s a p o p t o s i sa n dt h e s i g n a lp a t h w a y si nr e g u l a t i o no f c e l la p o p t o s i s M e t h o d s 1 B i m o l e c u l a r f l u o r e s c e n c e c o m p l e m e n t a t i o n w a su s e dt o i n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nL A S S 2a n dA T P 6 L T h ev e c t o r s p B i F C V C l 5 5 一L A S S 2 a n dp B i F C V N l 5 5 一A T P 6 Lw e r et r a n s f e c ti n t o S M M C 7 7 21c e l l s T h ee x p r e s s i o no fg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nw a s o b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yt od e t e r m i n et h ei n t e r a c t i o n si nt h e c e l la n dt h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h eh e t e r o d i m e r s 2 R e p l i c a t i o nd e f e c t i v er e c o m b i n a n ta d e n o v i r a lv e c t o rA d L A S S 2 h a db e e nc o n s t r u c t e dw i t hf u l ll e n g t hh u m a nL A S S 2g e n eb yu s i n g h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni nb a c t e r i aa n di n f e c t e dS M M C 7 7 2 1c e l l s T h e e x p r e s s i o no fg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nw a s o b s e r v e db yf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y t od e t e c tt h ee f f i c i e n c yo fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u s T h e e x p r e s s i o no fL A S S 2p r o t e i nw a sd e t e c t e db yw e s t e mb l o t 3 T h ep H s e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ep r o b e s B C E C F A Ma n dB C E C F w e r eu s e dt om e a s u r et h ei n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rH c o n c e n t r a t i o n s o fS M M C 7 7 21c e l l s 4 A f t e ro v e r e x p r e s s i o no fL A S S 2 t h ec e l lg r o w t ha n da p o p t o s i so f S M M C 7 7 21c e l lw a sd e t e c t e db yM T Ta s s a ya n df l o wc y t o m e t r ya f t e r a n n e x i nV P Id o u b l es t a i n i n g 5 T h el e v e l s o fp r o t e i n sc l e a v e d c a s p a s e 3 c l e a v e d c a s p a s e 9 I I I L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 B c l 2 B a xa n dp E R Kw e r ea s s e s s e db yW e s t e r nb l o t t i n g R e s u l t s 1 B i m o l e c u l a rf l u o r e s c e n c ec o m p l e m e n t a t i o na s s a yc o n f i r m e dt h e p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o nb e t w e e nL A S S 2a n dA T P 6 L t oe x p r e s s eB i F C s i g n a l sa n dt h ef l u o r e s c e n c es i g n a l sw e r el o c a t e di nt h ec y t o p l a s m 2 T h er e c o m b i n a n ta d e n o v i r a lv e c t o rA d L A S S 2w a ss u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e da n di n f e c t e dS M C 一7 7 2 M1c e l l s T h ee x p r e s s i o no fg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i nc o u l ds e ei nt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya n dt h e e f f i c i e n c yw a sm o r et h a n7 0 W e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e L A S S 2 p r o t e i nc o u l ds t a b l ee x p r e s si nc e l l s 3 O v e r e x p r e s s i o n o fL A S S 2c o u l di n c r e a s ei n t r a c e l l u l a ra n d d e c r e a s ee x t r a c e l l u l a r 矿c o n c e n t r a t i o n 4 T h eM T T a n df l o wc y t o m e t r ya s s a yi n d i c a t e do v e r e x p r e s s i o no f L A S S 2c o u l di n h i b i tS M M C 一7 7 21c e l l u l a rg r o w t ha n di n c r e a s ea p o p t o s i s r a t e 5 W e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a t t h el e v e lo fp r o t e i n sB a x c l e a v e d c a s p a s e 9a n dc l e a v e d c a s p a s e 3w e r ei n c r e a s e da n dt h el e v e lo f p r o t e i n sB c l 2a n dP E R Kw e r ed e c r e a s e d C o n c l u s i o n L A S S 2m a yI n t e r a c tw i t ht h eA T P 6 Lt ol n h i b i tt h ec a p a c i t yo f s e c r e t i o nI Tb yV A T P a s e O v e r e x p r e s s i o no fL A S S 2m a yi n h i b i tt h e a c t i v a t i o no fE R K l 2 d o w n r e g u l a t eB c l 一2a n du p r e g u l a t eB a xa n dt h e n a c t i v a t et h em i t o c h o n d r i a la p o p t o t i cp a t h w a ya n da c t i v a t ec a s p a s e 一9a n d c a s p a s e 一3a n df i n a l l yp r o m o t e t h ea p o p t o s i so fl i v e rc a n c e rc e l l s K E YW O R D S l i v e rc a n c e r L A S S 2 A T P 6 L p r o t o np u m p a p o p t o s i s a d e n o v i r u s I V 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 目录 1 1 1V A T P 的研究进展 1 1 1 1V A T P a s e 的结构 1 1 1 2V A T P a s e 的功能 3 1 1 3V A T P a s e 与肿瘤转移的关系 4 1 1 4V A T P a s e 对肿瘤细胞凋亡的影响 5 1 2L A S S 2 的研究进展 一6 1 2 1L A S S 基因家族 6 1 2 2L A S S 家族蛋白的结构 7 1 2 3L A S S 家族蛋白的功能 8 1 2 4L A S S 2 的结构与功能 8 1 2 5L A S S 2 对肿瘤转移的影响 9 1 2 昏L A S S 基因家族是一个潜在的癌症治疗的靶点 l O 1 3C a s p a s e s 与细胞凋亡的关系 l l 1 3 1 细胞凋亡的形态特征 1 1 1 3 2C a s p a s e s 的一般特点和分类 1 1 1 3 3 调控细胞内c a s p a s e s 活化的机制 1 2 1 3 4C a s p a s e s 的靶标蛋白 l3 1 4 本论文研究的目的 内容 意义 方法 实验方案的设计 1 6 1 4 1 研究目的 1 6 1 4 2 研究内容 16 1 4 3 研究意义 1 7 1 4 4 研究方法及技术 17 1 4 5 实验方案的设计 18 第二章L A S S 2 与质子泵相互作用的研究 1 9 2 1 材料和方法 1 9 2 1 1 材料 一1 9 2 1 2 方法 一2 1 2 2 结果 2 5 2 2 1L A S S 2 与A T P 6 L 的P C R 扩增产物鉴定 2 5 2 2 2p BjF C V C l5 5 L A S S 2 和p BiF c v N l5 5 A T P 6 L 的酶切鉴定 2 6 2 2 3L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用的BiF C 分析 2 6 2 2 4L A S S 2 过表达后S M M C 7 7 2 1 细胞内 外H 浓度变化 2 7 2 3 讨 仑 2 8 V L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 第三章重组腺病毒载体A d L A S S 2 的构建 3 1 材料和方法 3 1 1 材料 一 3 1 2 方法 一 3 2 结果 3 2 1L A S S 2 的P C R 扩增产物鉴定 3 3 第四章 3 2 2 质粒p M D 19 T L A S S 2 的酶切鉴定 3 2 3 穿梭质粒p A D T r a c k C M V L A S S 2 的酶切鉴定 3 2 4 骨架质粒p A d E a s y l C l V l V L A S S 2 的酶切鉴定 3 2 5 重组腺病毒A D L A S S 2 的包装 3 2 6 重组腺病毒A D L A S S 2 的P C R 鉴定 3 2 7 重组腺病毒A D L A S S 2 的滴度测定 3 8 3 2 8 荧光显微镜观察腺病毒A D L A S S 2 感染S M M C 7 7 2 1 细胞 3 8 3 2 9 腺病毒介导的外源基因L A S S 2 在S M M C 7 7 2 1 中的表达 3 9 讨论 3 9 A d L A S S 2 促进S M M C 7 7 2 1 肝癌细胞凋亡的研究 如 4 1 4 1 材料和方法 4 2 4 1 1 材料 4 2 4 2 4 3 第五章 1 2 方法 果 2 1L A S S 2 4 3 4 6 过表达对S M M C 7 7 2 1 细胞生长的影响 4 6 4 2 2L A S S 2 对S M M c 7 7 2 1 细胞凋亡的影响 4 7 4 2 3L A S S 2 对S M M C 7 7 2 1 细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响 4 8 4 2 4C l e a v e d C a s p a s e 一9 C I e a v e d C a s p a s e 一3 B c I 一2 B a x 的相对 定量分析 4 9 4 2 5 过表达L A S S 2 后S M M C 7 7 2 1 中E R K 磷酸化水平变化 4 9 讨论 一5 0 主要结论和展望 5 1 主要结论 5 3 5 2 展望 5 3 参考文献 英文缩写索引 致谢 攻读硕士学位期间发表的论文 V I 小结乱 4 2 3 4 5 6 6 6 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 L A S S 基因家族是在真核生物中发现的一类高度保守的基因 l a g l 是最先发 现的酵母长寿保障基因 随后 在其他生物体也发现T l a g l 同源体 包括哺乳动 物中的6 种同源体 所有的L A S S 基因都包含一个高度保守的L a 9 1 结够域 一些 还包括H o x 域 L A S S 编码的蛋白是神经酰胺合酶 对神经酰胺的合成起重要 作用 神经酰胺合酶也是鞘脂的生物合成途径中一个重要的酶 神经酰胺和鞘脂 类是在很多生物学过程如细胞生长 凋亡 应激 癌症的发展中关键的中间产物 L A S S 2 h o m os a p i e n sl o n g e v i t ya s s u r a n c eh o m o l o g u e2o fy e a s tL A G1 基因是由 上海市肿瘤研究所从人的肝c D N A 文库中首次发现的新基斟1 1 广泛存在于人的 多种组织中 尤其在肝和肾中高表达 编码一个四次跨膜螺旋的膜蛋白 分子量 为2 8 k D L A S S 2 蛋白是与酵母的寿命相关蛋I 圭t L A G l y e a s tl o n g e v i t ya s s u l a n c e g e n e1 具有高度的同源性 可能与神经酰胺的合成有关 2 J L A S S 2 基因是一个 肿瘤转移抑制基因 可以抑制前列腺癌 乳腺癌 肝癌 卵巢癌和胰腺癌的转移 L A S S 2 基因表达的蛋白能与V A T P a s e V a c u o l a r H A T P a s e 质子泵中的C 亚基相互结合 C 亚基又称A T P 6 L 1 6k D ap r o t e o l i p i ds u b u n i to fv a c u o l a r 一 A T P a s e 它是V A T P a s e 质子泵的关键跨膜部分 组成运输质子的孔道 利用R N A 干扰技术敲减A T P 6 L 后 肝癌细胞V A T P a s e 的活性降低 细胞内H 浓度上升 肿瘤细胞在小鼠中生长受到遏制 研究表明 L A S S 2 能抑制肝癌细 胞的克隆形成 C o l o n yf o r m a t i o n 提示L A S S 2 对癌细胞的生长有调控和影响 作用 1 1V A T P 的研究进展 1 1 1V A T P a s e 的结构 V A T P a s e 是一个与F A T P a s e 结构相似的分子马达1 3 1 在真核细胞中 F A T P a s e 产生A T P V A T P a s e 消耗A T P 当离子电势能大于A T P 水解的能量 时 合成A T P 而当水解A T P 的能量大于离子电势能时 A T P 水解驱动离子的 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 转运 V A T P a s e 是由1 4 种不同多肽组成的的多亚基蛋白 分为V 0 和V 1 两个 结构域 图1 1 位于胞浆的V l 结构域是不对称的 分子量约4 0 0 6 0 0 k D a 与A T P A D P 和磷酸盐作用 在真核生物中 V 1 结构域总是在细胞质中 以此泵出H 到官 腔 液泡和细胞外基质中 4 oV 1 结构域包括 由三个交替排布A 皿基和B 亚 基形成一个状环的帽子结构 由一个D 亚基和F 亚基组成中央的旋转柄结构 由C E G 和H 亚基构成外围的杆状结构 A 和B 亚基介导水解A T P 反应 中央的旋转柄结构和外围的杆状结构连接V 1 结构域和V 0 结构域 外围的杆状 结构固定V 1 结构域 通过B 和C 亚基结合到肌动蛋白上 C 亚基能够交联单 体肌动蛋白并稳定肌动蛋白丝 镶嵌在膜上的V 0 结构域 分子量约1 5 0 3 5 0 k D a 是一种脂蛋白 主要功能 为调节H 和N a 的转运 它含有五种不同的亚基 包括a d C C C 其中 最大的亚基V 0 a 11 0 k D 是一个完整的膜蛋白 在人 小鼠 线虫 果蝇中已鉴 定出四种亚型 a 1 a 4 在哺乳动物中 V 0 a l V 0 a 2 和V 0 a 3 广泛表达 V 0 a l 特别在脑组织中高表达 V 0 a 3 主要在成骨细胞高表达 而V 0 a 4 只在一些肾上皮 细胞 内耳和睫状体中表达f 5 1 V 0 a 3 突变将导致人和小鼠的骨硬化症 6 而V 0 a 4 突变导致肾小管性酸中毒1 7 其中C C c 有强的疏水性 参与形成质子通道 C C c 与F A T P a s e 的F 0 复合体的C 亚基 8 k D 有高度的同源性 可能属于同 一基因家族 8 J 2 江苏大学硕士学位论文 1 1 2V A T P a s e 的功能 图1 1V A T P a s e 的结构 F i gI 1S t r u c t u r eo ft h eV A T P a s e V A T P a s e 是A T P 依赖的质子泵家族的成员 分布于某些器官 组织的细胞 膜或细胞的囊泡 溶酶体 突触小泡 内体 分泌腺体 高尔基体质膜上 V A T P a s e 对细胞的正常生理活动至关重要 9 V A T P a s e 是一种A T P 驱动的酶 利用水解 A T P 产生的能量转运旷转化为电化学能 V A T P a s e 对维持细胞内的p H 对细 胞的生长和代谢有重要的作用 某些细胞器 如溶酶体 分泌小泡 s e c r e t o r y v e s i c l e s 内吞小体 e n d o s o m e 等的p H 的调节主要依赖于V A T P a s e V A T P a s e 在真核细胞管腔的酸化中起重要作用 1 0 1 管腔的酸化在多种重要 的细胞活动尤其是膜运输过程中起重要作用 在受体介导的内吞作用中 酸化的 内涵体激活释放内在的配体 这种机制让闲置的受体回收到细胞表面被再利用 而配体被溶酶体降解 内涵体酸化也是囊泡形成和激活内膜与包膜病毒 如流感 病毒 融合所必需的 1 1 在溶酶体和其他消化性细胞器如酵母中央液泡中 低 p H 值参与维持酸性水解酶的活性以降解大分子 在中央液泡和分泌小泡如突触 小泡和嗜铬颗粒囊泡中 V A T P a s e 产生质子梯度和膜电位可以推动小分子的转 运 V A T P a s e 也被证实在一些细胞中的细胞膜上发挥重要作用 位于胞膜上的 3 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 V A T P a s e 通过泵出旷酸化细胞外基质发挥一系列的作用 如骨硬化中的骨再 生1 1 2 1 附睾中精子的形成和储存 1 3 1 肾小管对碳酸盐的重吸收1 1 4 1 肾元末梢尿 酸化1 1 5 以及内耳中p H 的调控D 6 1 破骨细胞和肿瘤细胞的质膜v A r P a S e 能创造 一个酸性细胞外微环境 对于骨吸收或肿瘤转移有重要作用 研究证明V A T P a s e 是利用水解A T P 释放出来的能量将H 泵入到液泡中 从而维持细胞质中p H 平 衡 形成跨膜电化学梯度 为细胞代谢活动 以及各种离子和代谢物的运输提供 必不可少的条件f 用 在肿瘤组织内 V A T P a s e s 通过将一泵出膜外或囊泡内使 得胞外或囊泡酸化 维持碱性胞质溶胶与酸性胞外环境或酸性囊泡之间的异常高 p H 梯度 l s 1 1 3V A T P a s e 与肿瘤转移的关系 V A T P a s e 作为一类酶 在真核细胞中广泛存在 V A T P a s e 通过泵出H 到 细胞外环境或管腔细胞器中 参与维持相对中性的细胞内p H 值 酸性的肠腔p H 值 酸性的细胞外p H 值 3 l V A T P a s e 在多种高转移性肿瘤中高表达 并与肿瘤 的侵袭和转移有关 1 9 l 在肿瘤组织中 通过V A T P a s e 泵出质子导致细胞外酸化 有助于维持碱性的细胞质环境的和酸性细胞外环境 肿瘤细胞外酸性微环境可以 诱导蛋白酶分泌增加和激活 此外 细胞P H 氐p H 值 可通过激活蛋白水解酶促 进细胞外基质 E C M 的降解和重塑 从而促进癌细胞侵袭和转移 2 0 1 事实上 V A T P a s e 对癌症的侵袭和转移的促进作用主要依赖于他们对维持细胞外酸性微 环境和管腔中低p H 值的能力 在降解细胞外基质过程中 需要多种蛋白酶的活 化 分泌和再分布 这些蛋白酶需要一个低的细胞夕 p H 值以利于其激活 包括 基质金属蛋白酶 M M P I 型骨形态发生蛋白酶和组织丝氨酸蛋白酶 其中 M M P 本身参与E C M 的降解和重构 肿瘤转移是导致临床治疗恶性肿瘤失败的 最终原因 在整个癌症转移过程中 几乎都存在细胞外基质的降解与重构 因此 阻止E C M 的降解 已成为治疗肿瘤转移的准方法 然而 以往试验的靶点是利 用M M P 抑制剂抑制一个或几个M M P 却没有得到有效的结果 一个可能的主 要原因是 M M P 家族有2 0 个成员 而没有M M P 抑制剂能够同时抑制所有的 M M P 成员 2 研究表明 利用增加细胞外微环境的p H 值来抑制蛋白酶激活 阻碍E C M 的降解与重构过程 从而达到抑制肿瘤转移的效果 2 0 事实上 低转 4 江苏大学硕士学位论文 移潜能的乳腺癌细胞优先使用的N a H 交换器和基于H C O 孓的旷运输机制 高 转移细胞则更多的利用质膜的V A T P a s e 总之 这些体外和体内的研究结果表明 V A T P a s e 通过直接调节肿瘤微环境的p H 梯度 间接抑制细胞外基质中蛋白酶的 激活 可能成为治疗癌症的靶点 V l 结构域中的C 亚基是唯一与V 0 结构域分离的亚基 作为V l 与V 0 的桥梁 结合在E 和G 亚基上 对V 1 V 0 的稳定性有重要调节作用 有几种V A T P a s e 的抑 制剂 包括b a f i l o m y c i n c o n c a n a m y c i n l o b o t a m i d e s s a l i c y l i h a l a m i d e s c h o n d r o p s i n 和p o e c i l l a s t r i n 虽然它们表现出不同的强度和对人类与真菌的选择性 但都是通 过结合V A T P a s e 的C 亚基来达到抑制的作用1 2 2 A T P 6 L 是V A T P a s e 跨膜结构 域中的C 亚基 是跨膜质子运输通道 A T P 6 L 在高转移的胰腺癌中高表达 而 在低转移的胰腺癌中低表达 2 3 1 A T P 6 L 与整合素有直接作用 提示V A T P a s e 的 亚基可能影响整合素在膜系统上的循环及在细胞膜上分布 从而改变细胞的粘附 性 成纤维细胞中过表达A T P 6 L 会增力n M M P 2 的分泌 促进细胞的转移1 2 引 利用R N A 干扰技术敲减A T P 6 L 抑制V 二A T P a s e 的功能 能减少细胞内H 外排 下调蛋白酶活性 有效抑制癌细胞转移 2 5 1 靶向A T P 6 L 的R N A 干扰可以增强 M C F 7 细胞对化疗药物的敏感性 而且这种增敏作用不依赖于化疗药物的细胞 内靶点以及肿瘤耐药的机制1 2 引 1 1 4V A T P a s e 对肿瘤细胞凋亡的影响 哺乳动物细胞发生凋亡时发生细胞质酸化 酸化的程度一般在酸化0 3 O 4 p H 单位 这些诱导细胞质酸化的刺激包括过表达B a x 星形孢菌素 紫外辐射 依托泊苷 F a s 抗体 生长因子缺乏 生长抑素F f l l p 5 3 t 27 1 利用质膜N a H 泵和 V A T P a s e 抑制剂 表明H 转运子在凋亡中起作用 虽然它们不足以降低细胞 内H 以保持p H 中性 但可能是通过释放生长因子或其他保护物质来抵抗细胞 质酸化 2 引 细胞质酸化诱导的凋亡可以是c a s p a s e 依赖或非依赖的方式 C a s p a s e 募集到死亡受体复合物 导致直接激活死亡蛋白酶 2 9 F a s 诱导的细胞质酸化作 为c a s p a s e 激活的下游事件 可能是由于切割某个位于细胞质膜或其他内膜上的 细胞p H 调节器引起的 相比之下 依赖于线粒体的刺激 包括过表达B a x p 5 3 星形孢菌素和缺乏生长因子也可以诱导细胞质酸化 3 0 此外 细胞内p H 值的减 5 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 少发生在线粒体依赖的c a s p a S e 活化之前 生长因子对V A T P a s e 有促进作用 从 而阻止细胞酸化和维持细胞生存 因此 生长因子促进细胞存活的机制可能是维 持细胞内p H 值在碱性范围内 细胞质酸化在凋亡中的作用可能依赖于p H 对 c a S p a S e 和一些蛋白酶激活机制 例如 细胞色素C 通过与A p a f 1 蛋白结合诱导 c a S p a s e 激活 导致d A T P A T P 依赖的寡聚化反应 募集c a S p a u s e 9 前体 激活细 胞死亡蛋白酶 p H 值在诱导c a s p a s e 活化中具有重要的影响 这种反应的最适p H 值在6 4 左右 而在p H 值7 4 时 细胞色素C 介导的c a s p a s e 激活只有最大时的2 5 表明阻止细胞质酸化可以抑制线粒体依赖性的细胞凋亡 肿瘤细胞通过上调质子泵的活性如N a H 交换器和v A T P a s e 维持细胞内 碱性p H 和细胞外酸性p H 值 V 二A T P a s e 在调节肿瘤细胞异常p H 梯度起关键作 用 参与细胞生长 肿瘤发生发展 耐药性 可能是治疗癌症的一个新的靶点1 3 肿瘤细胞内产酸过多 细胞p H I n t r a c e l l u l a rp H p H i 有降低趋势 细胞p H i 降 低将诱导细胞凋亡 研究表明 过表达V A T P a s e 能促使多余的一外排 阻遏了 细胞凋亡的发生 而用V A T P a s e 的抑制剂 如B a f i l o m y c i n 能促进细胞凋亡 4 7 1 C 亚基A T P 6 L 基因敲除的小鼠胚胎着床后发育受到抑制 甚至死亡 3 2 干扰肝 癌细胞A T P 6 L 可能抑制V A T P a s e 或A T P 6 L 调控的信号通路 增加细胞夕 p H 下调血管生成促进因子如白介素 8 和V E G F 从而抑制细胞的增则3 3 1 2L A S S 2 的研究进展 1 2 1L A S S 基因家族 最早发现的L A S S 基因家族成员是在酵母中 特别在新生细胞中 命名为 长寿保障基因 1 a 9 1 该基因的缺失将增强酵母细胞复制能力 因此l a g l 是第 一个被鉴定的长寿基因 3 4 后来的研究表明 l a g l 的作用不仅仅是高表达减少寿 命这么简单 利用G e n B a n k 数据库确定了酵母l a g l 的同源体 命名为l a c l 的 l a g l 和l a c l 蛋白质被证明是多通道内质网膜蛋白 3 5 1 l a c l 与l a 9 1 突变将不能存 活或严重生长缺陷 生长缺陷的菌株表型是由于无法维持G P I 锚定蛋白从内质 网到高尔基的运输 而这种运输需要鞘脂合成 推测在l a g l 和l a c l 突变株中鞘 脂合成受阻 进一步研究证实了神经酰胺是鞘脂的合成中的关键中间物 3 6 纯 6 江苏大学硕士学位论文 化了对F B I 敏感的依赖乙酰辅酶A 的神经酰胺合酶正式确认了l a g l 和l a c l 是酵 母神经酰胺合酶的组成部分 F B l 的是真菌病原体中一种特异性抑制神经酰胺合 酶的化合物 L i p l 是用质谱分析发现鉴定的第三个l a g l l a c l 复合物的组成部分 是个一次跨膜的内质网蛋白 这一系列实验证实酵母神经酰胺合酶至少包括 l a g l l a c l l i p l 复合体 G e n B a n k 数据库搜索的l a g l 与l a c l 序列包含蠕虫 小鼠和人类的同源体p 这些蛋白质比较类似l a g l 尤其是高度保守的5 2 个氨基酸 被称为L a g l 域 3 副 随着越来越多的家族成员被鉴定 一直延伸到2 0 0 个氨基酸 在非酵母中 l a g 基因被叫做L A S S 1 0 n g e v i t ya s s u r e dh o m o l o g u eo f y e a s tl a 9 1 随着全基因组的 鉴定 发现所有的真核生物中都有L A S S 基因 除了L A S S l 脊椎动物的L A S S 蛋白都包含一个同源异型结构域 被发现在核转录调控子中 1 2 2L A S S 家族蛋白的结构 L A S S 蛋白家族以保守的位于C 末端的l a g l 结构域著称 L a g l 结构域包含 约2 0 0 个氨基酸 人L A S S 2 3 4 5 6 的l a g l 结构域包含1 9 8 或1 9 9 个氨基 酸 L a s s l 的L a g l 结构域包含2 1 3 个氨基酸 用C l u s t a l W 多序列比对法 在同 源体所有氨基酸中 有2 8 是至少8 0 保守的 只有1 5 是完全保守 然而 这种相对较低的保守性足以确保所有L A S S 家族成员的神经酰胺合酶的功能 最近 定点突变实验证明一些L a g l 结构域中保守的氨基酸对神经酰胺合成必不 可少的 H 1 8 2 H 1 8 3 L 1 8 9 D 2 1 0 D 2 1 3 L 2 1 6 而其他的一些氨基酸没有 作用 S 1 9 3 I 2 2 0 3 s L A S S 家族蛋白的L a g l 结构域包含在T r a m L a g C L N 8 T L C 结构域中 T L C 结构域在1 6 种蛋白中共有 包括L A S S 家族蛋白 虽 然T R A M 结构上与L a g l 结构域同源 但T R A M 蛋白不能弥补酵母l a g l l a c l 缺陷的致死性 表明其他包含有T L C 结构域的家族成员没有神经酰胺合酶活性 除L A S S l 外 所有脊椎动物的L A S S 蛋白都含有同源结构域 L A S S 蛋白 的同源结构域高度进化 只有C 端1 2 个氨基酸是高度保守的 而N 端是高度可 交的 然而 这种保守程度足够把它归为同源结构域 同源结构域通过螺旋 转 角 螺旋 H T H 结构结合D N A 因此 这些蛋白作为转录因子的功能 不仅在 胚胎发育 而且在癌症的发展中发挥重要的作用 3 9 l 同源结构域不像酵母l a g l 7 L A S S 2 与A T P 6 L 相互作用诱导肝癌细胞凋亡的研究 和l a c l 对神经酰胺合酶的功能是必需的 人L A S S l 有神经酰胺合酶活性 最近 的一项研究表明 人L A S S 5 和6 的同源域大部分对神经酰胺合酶活性是非必需 的 但延伸到T L C 结构域的1 2 个氨基酸是必需的 加 这个延伸区包括同源结 构域末端的8 个氨基酸 包含同源域的L A S S 蛋白可能由于同源域的关键作用 而具有除神经酰胺合酶以外的新的功能 1 2 3L A S S 家族蛋白的功能 人L A S S l 弥补了酵母l a g l l a c l 突变株致死性 因此L A S S l 是哺乳动物 的神经酰胺合酶一个组成部分 转染L A S S l 的人2 9 3 T 细胞的神经酰胺合成增 加 这种增加是对F B l 敏感和依赖于酰基辅酶A 第一次证明了L A S S l 在哺乳 动物细胞具有神经酰胺合酶活性 4 1 1 有趣的是 只有在C 18 酰基辅酶A 存在的 情况下 神经酰胺的合成增加 因此 这一结果表明哺乳动物L A S S 蛋白的神 经酰胺合成对脂肪酸的选择性 随后 对其他的哺乳动物L A S S 蛋白家族成员 的研究也证实了类似的结果 L A S S 2 显示出对长链脂肪酸 C 2 2 0 的偏好 L A S S 4 在参与合成更长的神经酰胺 C 2 2 0 和C 2 4 0 L A S S 5 和L A S S 6 产生 较短的神经酰胺 C 1 4 0 和C 1 6 0 相比之下 L A S S 3 表现出对脂肪酸酰基辅 酶A 相对较低的底物特异性 过表达L A S S 3 诱导产生C 1 8 0 C 2 2 0 和C 2 4 O 神经酰胺 2 4 2 L A S S l 产生C 2 6 0 L A S S 2 和L A S S 4 产生C 2 4 0 而L A S S 5 产生同样多的C 1 2 0 C 1 4 0 C 1 6 0 C 1 8 0 C 1 8 1 神经酰胺1 4 3 底物 特异性程度较低的可能是导致神经酰胺合酶活性在酵母和哺乳动物之间种属差 异的原因 正如前面提到的酵母神经酰胺合酶包含l a g l l a c l l i p l 复合体 而l i p l 仅在酵母中发现 在l i p l l a c l l a g l 酵母突变株中 L A S S 5 可以弥补神经酰胺 的合成 1 2 4L A S S 2 的结构与功能 L A S S 2 基因是上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室于1 9 9 8 年首先获得基因的全长 1 9 9 9 年首先将该基因的e D N A 序列在G e n B a n k 上登录 登录号为A F l 7 7 3 3 8 L A S S 2 基因在正常人肝组织和肾组织中高表达 放射杂 交基因定位在人染色体l q ll L A S S 2 基因是长寿保障基因家族的一员 1 1 L A S S