乳铁蛋白PPT课件.ppt

乳铁蛋白 2020 2 5 1 乳铁蛋白不仅参与铁的转运 而且具有广谱抗菌 抗氧化 抗癌 调节免疫系统等强大生物功能 被认为是一种新型抗菌 抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂 乳铁蛋白 Lactoferrin Lf 是一个大约有700个氨基酸残基构成的 分子量约为80KDa的单体糖蛋白 属于转铁蛋白家族 主要由乳腺上皮细胞表达和分泌 因其晶体呈红色 故也有学者称之为 红蛋白 定义 2020 2 5 2 乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中 包括泪液 精液 胆汁 滑膜液等内 外分泌液和嗜中性粒细胞 人乳中乳铁蛋白浓度约为1 0 3 2mg ml 是牛乳中的10倍 牛乳中含量为0 02 0 35mg ml 占普通母乳总蛋白的20 分布 2020 2 5 3 血液中乳铁蛋白主要来自中性白细胞 骨髓 子宫内膜及胎盘等也能分泌少量的乳铁蛋白进入血液 2020 2 5 4 2020 2 5 5 人在泌乳期间 乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化 如人初乳中乳铁蛋白可达6 14mg ml 常乳期降至1mg ml 2020 2 5 6 乳铁蛋白由700个左右的氨基酸组成 人乳铁蛋白分子量为82 4KDa 有692个氨基酸残基 牛乳铁蛋白分子量为83 1KDa 由689个氨基酸组成 乳铁蛋白N端 1 338 与C端 339 692 两个球状结构相应位置上有37 125个 的氨基酸完全相同 结构及性质 人乳铁蛋白与牛乳铁蛋白结构相似 氨基酸残基组成单链 两端折叠成球形 N叶和C叶 中间由一段螺旋肽链连接呈现 二枚银杏叶型 结构 2020 2 5 7 在晶体结构中Phe17 Leu29间肽链形成 螺旋结构 Ser33 Arg39间无规则卷曲结构并使一个平行 折叠结构与N端相连 Phe17 Leu29间肽段具有较强的抗菌活性 如果将其a 螺旋变成 折叠结构抗菌活性有较大提高 可能是由于 折叠结构易于细菌表面接触的缘故 每个分子中有2个金属结合位点 每个位点可结合一个Fe3 和一个HCO3 或CO32 2020 2 5 8 乳铁蛋白对胰蛋白酶类具有很强的抗降解能力 尤其是结合铁离子后抗降解能力增强 因此在肠道内不易被降解 能以完整分子的形式被吸收 这种抗蛋白酶水解的特性可能与糖基化有关 在铁离子结合结构域中包括三个阴离子配子体 两个酪氨酸残基 一个天冬氨酸残基 和一个组氨酸残基 可与铁离子形成稳定的结合 在酸性条件下对热稳定 在碱性条件下 高于80 即开始凝胶化 2020 2 5 9 根据Lf结合Fe的多寡 可将其分为缺铁型乳铁蛋白 apoLf 铁半饱和型乳铁蛋白和铁饱和型乳铁蛋白 Holoix 三种形式 不同形式的Lf具有不同的抗变性能力 其抗巴氏杀菌热变性能力依次为 Holoix 铁半饱和型乳铁蛋白 apoLf 牛乳Lf的等电点pH值为8 2左右 人Lf的等电点为6左右 2020 2 5 10 1 乳铁蛋白具有广谱抗菌作用 Lf抑菌效果取决于微生物对铁的需求程度 外源铁的生物利用率 Lf的铁饱和度 盐类 pH值 抗体或其他免疫物质 介质等 生物学功能 2020 2 5 11 首先 Lf对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌作用是由于乳铁蛋白高度结合铁 使细菌失去生长所需的基本元素铁 其次 Lf通过氨基末端强阳离子结合区域 增加细菌细胞膜的通透性 使细菌的脂多糖从外膜渗出 达到直接杀菌作用 另外 Lf可通过水解得到的抗菌肽来实现抗菌作用 将Lf通过蛋白酶水解获得一些低分子量的肽 这些肽的抗菌活性大幅度增强 可抑制G 和G 菌生长 其中包括一些对Lf具有抵抗性的菌株 目前认为Lf的抗菌机理可能有以下3个方面 2020 2 5 12 2 乳铁蛋白具有抗病毒作用 天然的Lf能够抑制人免疫缺陷病毒和巨细胞病毒对MT4细胞和成纤维细胞的病变作用 此外 还具有抑制流感病毒的活性 主要是因为其碳水化合物残基上含唾液酸 它干扰病毒对靶细胞的结合和侵染 乳铁蛋白通过抑制病毒进入细胞 减轻对人体肝细胞的损害 2020 2 5 13 3 乳铁蛋白具有抗氧化作用 研究结果显示 乳铁蛋白能抑制铁诱导的脂质过氧化过程所产生的硫代巴比妥酸和丙二醛的生成 另外 牛乳铁蛋白能降解酵母中的tRNA 具有核糖核酸酶的活性 且能抑制超氧离子的形成 所有这些都可降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏 达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的 2020 2 5 14 2020 2 5 15 4 乳铁蛋白具有抗癌作用 乳铁蛋白对消化道肿瘤 如结肠癌 胃癌 肝癌 胰腺癌 具有化学预防作用 并可抑制由此引发的肿瘤转移 另外 乳铁蛋白在启动宿主防御系统的初始活化反应 调控不同类型淋巴细胞比例的改变对机体免疫反应的影响 提高免疫力等方面都起到了促进作用 2020 2 5 16 5 乳铁蛋白调节机体免疫反应 乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力 而且嗜中性粒细胞是含乳铁蛋白最多的细胞 在机体受感染时可以将乳铁蛋白释放出来 释放出的乳铁蛋白夺取致病菌的铁离子致使后者死亡 另外 经研究显示 乳铁蛋白对抗体生成 T细胞成熟 淋巴细胞中自然杀伤细胞比例都具有调节作用 2020 2 5 17 6 乳铁蛋白调节胃肠道铁的吸收 乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个铁结合区域能高亲和性地 可逆地与铁结合 并维持铁元素在一个较广的pH值范围内完成铁在十二指肠细胞的吸收和利用 2020 2 5 18 7 乳铁蛋白同药物的协同作用 研究显示 乳铁蛋白能同多种抗生素和抗病毒药物协同作用 减少药物用量 降低抗生素或抗真菌制剂对人肝 肾功能的损害 同时 增强体内微生物对药物的敏感性 2020 2 5 19 2020 2 5 20 影响Lf功能的因素 实验证明 婴儿或仔畜出生初期 Lf降解程度很低 随后迅速升高 生理功能也逐渐消失 Lf的抑菌作用具有很强的铁依赖性 只有在其处于不饱和状态时 才具有较强的抑菌能力 而在Lf呈铁饱和状态时 抑菌作用也不复存在 pH值也影响Lf的活性 在pH中性环境中 Lf活力较强 当pH 6时 则基本无抑菌功能 盐的种类明显影响Lf的抑菌能力 碳酸盐可增强Lf的抑菌作用 而柠檬酸盐则会减弱Lf的抑菌作用 肠液内存在HC03一 因此有利于Lf发挥抑菌功能 此外 抗体或其他免疫物质也会影响Lf的抑菌能力 例如 Lf和初乳中的IgA IgG就具有协同抑菌的作用 Lf只有在维持其活性不被降解的前提下 才能发挥生理功能 2020 2 5 21 乳铁蛋白的生产制备方法 牛初乳富含LF 可采用色谱法 超滤法 盐析法 酸沉淀法等方法从初乳中提取乳铁蛋白 牛初乳经冷冻离心机脱脂 35 下加入适当稀释的皱胃酶液 分离去除酪蛋白 微滤后即为用于超滤研究的物料 用MWCO为100000的超滤膜进行首次超滤 透过液再用MWCO为50000的超滤膜进行第二次超滤 然后用MWCO为10000的超滤膜进行浓缩 冷冻干燥 即得到Lf的粗品 超滤法 2020 2 5 22 Lf的分离纯化及检测方法 目前鉴定乳铁蛋白的方法主要有 免疫双扩散法 酶联免疫检测法 ELISA 反相高效液相色谱法等 2020 2 5 23 反相高效液相色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量 色谱条件色谱柱 KromasilC4色谱柱 250mm 4 6mm 5 m 流动相 乙腈 水 三氟乙酸 80 20 0 1 流速0 6mL min 检测波长 220nm 柱温 25 进样量10 0 L 样品溶液的制备量取新鲜牛初乳离心除脂肪 得到的脱脂乳调pH值至4 6 离心除酪蛋白 收集乳清 然后调pH值至6 8 加硫酸铵使饱和度达到40 离心取乳清液 用截留分子量为300Ku 100Ku 30Ku的超滤膜包进行超滤 收集30Ku膜包超滤后的回留液进行离子交换层析 收集洗脱峰 即为样品溶液 2020 2 5 24 精密称取乳铁蛋白标准品1mg 配制浓度分别为1 0 5 0 25 0 125 0 05 0 025mg mL的对照品溶液 乳铁蛋白进样量浓度在25 1000g mL时 线性关系良好 2020 2 5 25 取样品进行RP HPLC检测 如图3所示为离子交换层析后收集各洗脱峰 其中峰1 2为未吸附蛋白流穿液 峰3为低盐浓度洗脱液 峰4为高盐浓度洗脱液 即提取的乳铁蛋白洗脱液 图4为峰4洗脱液经RP HPLC检测结果 结果显示牛初乳经除脂肪 除酪蛋白 超滤和离子交换层析后 提取的乳铁蛋白的平均纯度为92 23 RSD为1 3 2020 2 5 26 作为一种高效补铁组分 Lf可用作食品添加剂 以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状 也可制成含铁饮料或补铁胶囊 用来提高造血功能 改善贫血 在食品或乳制品 如婴幼儿奶粉 甚至口香糖中 添加Lf可调节免疫功能 国外在乳制品中补充益生菌和Lf 制成片剂或速溶饮料 作为运动员的营养品 把Lf添加到碳酸饮料 焙烤食品中既具营养价值 又可